本发明涉及生物技术领域，尤其涉及大豆胞囊线虫抗性相关Map-5149SNP标记及检测方法与鉴定利用。
背景技术：
大豆胞囊线虫(Soybean Cyst Nematode，SCN)具有分布广，危害重，传播途径多，寄主范围广，存活时间久等特点，是一种极难防治的土传病害，其发生可对大豆生产造成毁灭性打击，目前，该病害具有蔓延及日趋加重的趋势，已经严重制约了大豆生产。实践证明，培育和种植抗病品种是防治病害的最有效途径。由于SCN抗性基因在遗传上的复杂性和大豆胞囊线虫生理小种的多样性，利用传统抗病表型鉴定和育种方法培育抗大豆胞囊线虫病的品种不但需要花费很长的时间，而且难于成功，已经不能够满足当前抗线育种的发展。随着分子标记的开发和使用，分子标记辅助选择(Molecular marker-assisted selection，MAS)成为可以节约人力、物力和加速育种进程的有效方法(Cregan et al.1999)。MAS的最大优点是在不需要评估表型特征的情况下，通过确认是否带有目标基因而鉴定出抗性植株。
经典遗传分析表明，大豆胞囊线虫的抗性是受多个位点控制的数量性状，虽然两个主要抗病位点(rhg1和Rhg4)被克隆(Cook et al.Science,2012；Liu et al.Nature,2012)，但无法解释全部抗性变异，无法满足育种需要，有必要继续发掘新的抗病基因。大豆起源于我国，我国的抗源最丰富，其中蕴藏着优异抗病基因。关联分析，又称关联作图(Association Mapping)，是一种以LD(Linkage Disequlibrium)分析为基础，直接对基因型变异和表型变异进行分析，从而把那些与性状有关联的基因鉴定出来(Khush et al.2001)，关联分析方法已成为发掘与表型相关分子标记的强有力工具。新型分子标记—SNP因为具有在基因组中数量多、分布广泛、可高通量检测等优点而在近年广泛用于鉴定多基因控制的复杂性状。随着SNP标记数量的不断增多，高通量的SNP分型平台不断推出，包括BeadArray(Illumina)，GenomeLab SNP stream(Beckman)和MegAllele(Affymetrix)等，其中Illumina公司的BeadArray芯片鉴定技术具有高效、高通量、成本低、准确性好等优点，适合位点数从几十到几千的中等通量基因分型研究，实验成功率>99％，是理想的中等通量基因分型检测的解决方案，目前已被广泛用于人类、拟南芥、水稻等物种的SNP分型。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供检测大豆基因组中Map-5149SNP位点的多态性或基因型的物质的用途。
本发明提供的检测大豆基因组中Map-5149SNP位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定大豆对大豆胞囊线虫3号生理小种抗性中的应用。
所述检测Map-5149SNP位点的多态性(即等位基因)或基因型具体可为检测Map-5149SNP位点的核苷酸种类。
本发明另一个目的是提供检测大豆基因组中Map-5149SNP位点的多态性或基因型的物质的另一个用途。
本发明提供了检测大豆基因组中Map-5149SNP位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定大豆对大豆胞囊线虫3号生理小种抗性产品中的应用。
本发明第三个目的是提供检测大豆基因组中Map-5149SNP位点的多态性或基因型的物质的第三个用途。
本发明提供的检测大豆基因组中Map-5149SNP位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定抗病大豆中的应用；所述病为由大豆胞囊线虫3号生理小种引发的病；
或检测大豆基因组中Map-5149SNP位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定抗病大豆产品中的应用；所述病为由大豆胞囊线虫3号生理小种引发的病。
本发明第四个目的是提供检测大豆基因组中Map-5149SNP位点的多态性或基因型的物质的第四个用途。
本发明提供了检测大豆基因组中Map-5149SNP位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定与大豆胞囊线虫3号生理小种抗性相关的单核苷酸多态性中的应用；
或检测大豆基因组中Map-5149SNP位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定与大豆胞囊线虫3号生理小种抗性相关的单核苷酸多态性产品中的应用。
本发明第五个目的是提供检测大豆基因组中Map-5149SNP位点的多态性或基因型的物质的第五个用途。
本发明提供了检测大豆基因组中Map-5149SNP位点的多态性或基因型的物质在筛选或辅助筛选抗病大豆中的应用；所述病为由大豆胞囊线虫3号生理小种引发的病；
或检测大豆基因组中Map-5149SNP位点的多态性或基因型的物质在制备筛选或辅助筛选抗病大豆产品中的应用；所述病为由大豆胞囊线虫3号生理小种引发的病。
上述应用中，所述大豆基因组中Map-5149SNP位点基因型为TT或CC；
所述Map-5149SNP位点位于大豆基因组第8条染色体的Glyma.08g234500基因的第2307位；所述Glyma.08g234500基因的核苷酸序列为序列1。
所述检测大豆基因组中Map-5149SNP位点的多态性或基因型的物质包括Map-5149SNP固定用于检测Map-5149SNP位点的探针组的SNP基因型芯片；
所述探针组由序列表中序列1所示的单链DNA分子、序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。
本发明的第六个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定大豆对大豆胞囊线虫3号生理小种抗性的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测大豆基因组Map-5149SNP位点基因型，若所述待测大豆基因组Map-5149SNP位点基因型为TT，则所述待测大豆为或候选为抗病品种；若所述待测大豆基因组Map-5149SNP位点基因型为CC，则所述待测大豆不为或候选不为抗病品种；所述病为由大豆胞囊线虫3号生理小种引发的病；
所述检测待测大豆基因组Map-5149SNP位点基因型采用下述固定用于检测Map-5149SNP位点的探针组的SNP基因型芯片检测。
本发明第六个目的是提供检测大豆基因组中Map-5149SNP位点的多态性或基因型的物质。
本发明提供的检测大豆基因组中Map-5149SNP位点的多态性或基因型的物质，为a)-d)中的任一种产品：
a)鉴定或辅助鉴定大豆对大豆胞囊线虫3号生理小种抗性的产品；
b)鉴定或辅助鉴定抗病大豆的产品；所述病为由大豆胞囊线虫3号生理小种引发的病；
c)鉴定或辅助鉴定与大豆胞囊线虫3号生理小种抗性相关的单核苷酸多态性产品；
d)筛选或辅助筛选抗病大豆产品；所述病为由大豆胞囊线虫3号生理小种引发的病；
所述Map-5149SNP位点的所在基因为大豆基因组第8条染色体的Glyma.08g234500基因；所述Glyma.08g234500基因的核苷酸序列为序列1；
所述Map-5149SNP位点为序列表中序列1第2307位。
上述产品中，所述检测大豆基因组中Map-5149SNP位点的多态性或基因型的物质包括Map-5149SNP固定用于检测Map-5149SNP位点的探针组的SNP基因型芯片；
所述探针组由序列表中序列1所示的单链DNA分子、序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。
本发明的实验证明，本发明筛选出Map-5149SNP位点，通过检测其的基因型可以在品种早期对育种材料进行大豆胞囊线虫3号生理小种抗性，极大提高了育种过程中抗病品种的选择效率、缩短育种时间，对于抗大豆胞囊线虫品种的培育效果显著。
具体实施方式
下面实施例中表3的高代品系是以中国农业科学院作物科学研究所繁育的中品03-5373(张姗姗等，作物学报,2013,39(10):1746-1753；刘章雄等，大豆科学，2008,27(6):911-914)为母本、中黄13(ZDD23876)为父本杂交构建F2群体、株行混收法繁殖 F2-4、单粒传法繁殖F5～F10而衍生的F5:10代高代品系。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、Map-5149SNP位点是与大豆胞囊线虫3号生理小种抗病相关的单核苷酸多态性
Map-5149单核苷酸多态性位点位于Glyma.08g234500基因核苷酸序列(序列1)第2307位，其基本信息见表1。
表1、Map-5149SNP单核苷酸多态性位点基本信息
二、Map-5149SNP基因型与大豆胞囊线虫3号生理小种抗病的关联分析
1、大豆品种对大豆胞囊线虫3号生理小种的抗病检测
将表2和表3中的大豆品种均在田间病圃与温室两种环境条件下接种大豆胞囊线虫3号生理小种。在田间采用完全随机区组试验设计方案，重复三次。田间种植行宽0.65米，行长1.5米，株间距0.05米。温室采用盆栽鉴定，每个品种种植3盆，每盆种植5株。出苗30天后，对田间和温室的每份材料均随机选择长势相同10株进行鉴定，数每株胞囊数，计算每个鉴定品种的平均胞囊数。为了检测胞囊指数(Female Index，FI)差异，每隔40行以中品03-5373作为抗病对照，中黄13作为感病对照。以基于胞囊指数划分的抗病等级评估每个品种的抗性。胞囊指数的计算公式为FI＝(鉴定品种每株平均胞囊数/感病对照品种的平均胞囊数)X 100％，每份材料以离其最近的中黄13为感病对照品种)。抗感分级标准如下，FI＝0-9为抗病(Resistant,R)；FI＝10-29为中抗(moderately resistant,MR)；FI＝30-59为中感(moderately susceptible,MS)；FI＝60+为感病(susceptible,S)，结果如表2和表3所示。
2、基因型芯片检测SNP基因型
1)、Map-5149 SNP位点基因型芯片的制备
根据自主开发的全基因组SNP数据集，筛选Rhg4区间(长度为2.8Mb)的Map-5149 SNP位点设计成Map-5149 SNP位点基因型鉴定芯片，具体如下：
根据SNP位点分析设计和人工合成Map-5149SNP探针组：
探针A：ACTTCGTCAGTAACGGACTTATTGTTGAGGGATTGGCGAGT(序列2)；
探针B：GAGTCGAGGTCATATCGTTTATTGTTGAGGGATTGGCGAGC(序列3)；
探针C：ATCTCTTCGTAAATCTCAATCGGAAGGGTTGAGCCTAACGTCTTGGTCTGCCTATAGTGAGTC (序列4)；
Map-5149 SNP位点基因型芯片为将上述人工合成的Map-5149SNP探针组的3条探针均固定到芯片(美国Iillumina公司)上，得到Map-5149 SNP位点基因型芯片。
2)、基因型检测
利用Iillumina的SNP检测平台对表2中所示的133个大豆品种和表3中所示的244个大豆高代品系进行SNP基因型鉴定，具体如下：
(1)、提取各个品种的基因组DNA 250ng。
(2)、将待检测DNA样品加入含有预先根据SNP位点设计的探针组OPA的芯片微珠。
(3)、芯片的微珠上连接有地址序列的互补序列，通过地址序列完成杂交，并在芯片上进行单核苷酸碱基延伸，得到一段包含该SNP位点的片断。
(4)、清洗和扫描芯片。
(5)、利用BeadArray Reader软件根据荧光颜色判读并输出分型结果，确定待测品种的基因型。结果如表2所示。
表2为大豆品种SNP位点基因型
上述表2涉及的品种均记载在如下文献中：王国勋.中国大豆品种资源目录.北京:中国农业出版社,1982；常汝镇,孙建英.中国大豆品种资源目录:续编一.北京:农业出版社,1991；常汝镇,孙建英,邱丽娟,陈一舞.中国大豆品种资源目录:续编二.北京:中国农业出版社,1996；张姗姗，李英慧，李金英，邱丽娟.优良品系中品03-5373系谱的遗传解析及抗大豆胞囊线虫病相关标记鉴定.作物学报,2013,39(10):1746-1753.
表3为中品03-5373和中黄13衍生的217个大豆高代品系SNP位点基因型
表2结果显示，34个大豆抗病品种中30个品种的Map-5149 SNP位点的等位基因基因型为TT；17个大豆感病病品种中15个品种的Map-5149 SNP位点的等位基因基因型为CC。
计算表2中抗病品种或品系鉴定效率(携带TT等位基因的抗病品种/所有的抗病品种)，抗病品种或品系鉴定效率为88.2％。
计算表2中感病品种或品系鉴定效率(携带CC等位基因的感病品种/所有的感病品种)；感病品种鉴定效率为88.2％。
表3结果显示，中品03-5373和中黄13杂交衍生的28个抗病高代品系中，26个高代品系的Map-5149 SNP位点的等位基因基因型为TT；189个大豆感病高代品系中116个高代品系的Map-5149 SNP位点的等位基因基因型为CC。
计算表3中抗病高代品系鉴定效率(携带TT等位基因的抗病高代品系/所有抗病高代品系)，抗病高代品系鉴定效率为92.9％。
计算表3中感病高代品系鉴定效率(携带CC等位基因的感病高代品系/所有感病高代品系)，感病高代品系鉴定效率为61.4％。
上述方法可以用于鉴定待测大豆对大豆胞囊线虫3号生理小种的抗性。