一种检测Her2基因的试剂盒及其用途的制作方法

本发明公开了一种用于检测Her2基因相对表达量的试剂盒。具体地，所述的试剂盒含有Her2基因的特异性引物和检测探针，可用于荧光定量PCR的方法及计算检测Her2基因表达量变化。

背景技术：

胃癌发病率和死亡率均居全球恶性肿瘤前列，总体5年生存率为10％-40％。接受根治性切除的进展期胃癌患者，中位总生存期约24个月，而姑息切除术后者仅为8.1个月，对于无法手术或发生转移的患者，联合化疗所获得的中位总生存期仅为12个月左右。晚近，以分子靶向治疗为代表的新型治疗手段逐渐从实验室向临床应用转化。就胃癌分子靶向治疗的靶点选择和药物开发而言，目前研究较多者，除抗肿瘤血管生成药物外，还包括Her/erbB受体家族，已有针对上述靶点的药物(曲妥珠单抗-Herceptin)在I、Ⅱ和Ⅲ期临床研究阶段显示了良好疗效。由于大部分临床胃癌患者依然难以早期发现，胃癌的诊断还是依靠胃镜检查确诊为主。

Her2受体(也称c-erbB-2，HER2/neu)是分子量为185kD、具酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，其编码基因定位于人染色体17q21，是表皮生长因子受体家族的成员。HER2基因过度表达可导致细胞过度增殖和表型恶性转化。研究表明有30％的乳腺癌患者Her2基因过度表达，这类患者肿瘤恶性程度高、复发和转移发生早、预后差，对某些化疗药物有抵抗，并且发现HER2基因过度表达与患者的无病生存和总的生存期有关。将肿瘤的生物标志物作为肿瘤治疗反应的重要预测指标是肿瘤生物学研究的主要目的之一。

临床上对于Her2阴阳性的确定还是主要依靠免疫组化IHC学方法和荧光免疫杂交FISH法来确定。IHC法对抗体要求很高，且对于判断带有很强的主观判断意识以及17号染色体多体的干扰的影响，常造成检测结果的差异；FISH法虽然消除了17号染色体多体干扰，但是其价格昂贵、荧光淬灭导致结果无法产期保存，技术要求较高，且耗时。目前Her2的检测策略是通过IHC进行 初筛,结果为弱阳性(++)者再做FISH加以确认,此检测策略已在英国获得推荐。但目前尚没有一种方法可作为评估HER2的标准方法而被普遍接受。

因此，本领域迫切需要开发一种能够准确定量或定性检测Her2基因的方法。

技术实现要素：

本发明提供了一种适用于Her2基因荧光定量PCR的高特异性、高灵敏度引物和探针组合。

本发明第一方面，提供了一种Her2基因检测试剂盒，所述的试剂盒含有容器，以及分别位于容器内的：

Her2基因特异性引物对，所述的特异性引物对如SEQ ID NO.:1(正向ACAACCAAGTGAGGCAGGTC)和SEQ ID NO.:2(反向GTATTGTTCAGCGGGTCTCC)所示；和

Her2基因特异性检测探针，Her2基因特异性探针序列如SEQ ID NO.:3(CCCAGCTCTTTGAGGACAAC)所示。

在另一优选例中，所述的Her2基因来源于哺乳动物，较佳地，来源于小鼠、大鼠、人。

在另一优选例中，所述的Her2基因的Gene ID:2064，(NCBI Reference Sequence:NM_001289936.1)

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有对照基因的特异性引物对和特异性检测探针。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有任选的PCR检测相关试剂，如mastermix、蒸馏水等。

在另一优选例中，所述的PCR检测相关试剂没有特别限制，可为任何PCR检测所需要的扩增、指示试剂，可自商业购买来源获得，如Taqman GEMM mastermix。

在另一优选例中，所述对照基因的特异性检测探针的报告基团与Her2基因的报告基团不同。

在另一优选例中，所述的对照基因的特异性引物对序列如SEQ ID NO.:4(正向GCTGATGATCATAAAGCCACAGGTA)和SEQ ID NO.:5(反向TGGTGCTCAGGCAGTGC)所示；和/或所述特异性检测探针序列如SEQ ID NO.:6(TGCTGCAATAGGCGG)所示。

在另一优选例中，所述的特异性检测探针上的一端标记有荧光发生基团，另 一端标记有荧光淬灭基团。

在另一优选例中，所述检测探针的5’端标记FAM荧光基团，且检测探针的3’端标记MGB荧光淬灭基团。

在另一优选例中，所述的检测探针可以和Her2基因的核酸序列特异性结合。

在另一优选例中，所述的特异性引物的浓度为2.5-8uM/ul，优选为3-5uM/ul，例如4.5uM/ul。

在另一优选例中，所述的特异性检测探针的浓度为0.5-5uM/ul，优选为1-2uM/ul。

本发明第二方面，提供了一种非诊断性的检测样本中Her2基因拷贝数方法，包括步骤：

一种非诊断性的检测样本中Her2基因相对拷贝数方法，其特征在于，包括步骤：

(i)提供一反应体系，所述反应体系含有Her2基因的特异性引物对和特异性探针、以及对照基因的特异性引物对和对照基因；

(ii)利用(i)中的反应体系对Her2基因和对照基因进行PCR扩增；

(iii)分别测定所述Her2基因和对照基因的特异性探针发出的荧光信号，从而检测Her2基因相对于对照基因的相对拷贝数；

其中，所述的Her2特异性探针如SEQ ID NO.:3所示；所述的Her2基因特异性引物对如SEQ ID NO.:1(Fw)和SEQ ID NO.:2(Rv)所示。

在另一优选例中，所述对照基因包括Cep17基因。

在另一优选例中，所述对照基因(Cep17基因)的特异性引物对如SEQ ID NO.:4(正向GCTGATGATCATAAAGCCACAGGTA)和SEQ ID NO.:5(反向TGGTGCTCAGGCAGTGC)所示；和/或所述特异性探针序列如SEQ ID NO.:6(TGCTGCAATAGGCGG)所示。

在另一优选例中，所述的测定为定量或定性测定。

在另一优选例中，所述的PCR扩增反应条件如下：

95℃10分钟；92℃15秒，60℃60秒，40个循环。

在另一优选例中，所述的样本包括组织样本、或血液样本。

在另一优选例中，所述的组织样本包括肿瘤组织、或癌旁组织。

在另一优选例中，所述的肿瘤组织包括胃癌组织、乳腺癌组织、结直肠癌组织。

本发明第三方面，提供了本发明第一方面所述试剂盒的用途，用于诊断或非诊断性检测样品中Her2基因的表达量。

在另一优选例中，所述的检测包括诊断性检测和非诊断性检测。

本发明第四方面，提供了一种检测样本中Her2基因相对拷贝数和/或判断个体内Her2基因是否为阳性的方法，包括步骤：

(i)提供一反应体系，所述反应体系含有Her2基因的特异性引物对和特异性探针、以及对照基因的特异性引物对和对照基因；

(ii)利用(i)中的反应体系对Her2基因和对照基因进行PCR扩增；

(iii)分别测定所述Her2基因和对照基因的特异性探针发出的荧光信号，从而检测Her2基因相对于对照基因的相对拷贝数；

其中，所述的Her2特异性探针如SEQ ID NO.:3所示；所述的Her2基因特异性引物对如SEQ ID NO.:1(Fw)和SEQ ID NO.:2(Rv)所示；

在另一优选例中，当Her2/Cep17拷贝数比值≥2时，判断Her2基因为阳性。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为试剂盒检测样品的PCR扩增曲线，图中横坐标PCR循环数Cycles，纵坐标为扩增反应的荧光值Fluorescence(dRn)。1A为胃正常组织对照组的荧光定量PCR检测的Her2(红色或浅灰色(灰度下))和CEP17(蓝色或深灰色(灰度下))基因扩增曲线。1B为IHC和FISH鉴定的胃癌Her2阳性组织的荧光定量PCR检测的Her2(红色)和CEP17(蓝色)基因扩增曲线。1C为经过IHC和FISH鉴定的胃癌Her2阴性组织的荧光定量PCR检测的Her2(红色)和CEP17(蓝色)基因扩增曲线。

图2为本发明基于荧光定量PCR检测Her2基因拷贝数定量计算ΔΔCt的值方法示意图。

图3为本发明中设计筛选出的两条Her2基因检测探针，基于荧光定量PCR检测扩增曲线图。图中横坐标PCR循环数Cycles，纵坐标为扩增反应的荧光值Fluorescence(dRn)。3A为本发明中探针SEQ ID NO.:3和阳性对照探针检测 基因所得扩增曲线。3B为探针SEQ ID NO.:7和阳性对照探针检测基因所得扩增曲线。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过筛选了大量Her2基因的PCR引物，筛选出一对能够高效扩增Her2基因的引物对，该引物对所产生的扩增条带清晰无弥散，此外，本发明人还通过进一步对Her2基因探针进行了设计和筛选，并获得了SEQ ID NO.:3所示的荧光探针，其与本发明引物对的组合能够有效、准确地测定Her2基因的拷贝数，且灵敏度和特异性极高，与IHC或FISH组合的各自吻合度均高于IHC和FISH组合吻合度，能够作为临床上FISH或IHC检测Her2基因的有效补充甚至是替代方法。在此基础上，完成了本发明。

Her2基因

Her2受体(也称c-erbB-2，HER2/neu)是分子量为185kD、具酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，其编码基因定位于人染色体17q21，是表皮生长因子受体家族的成员。HER2基因过度表达可导致细胞过度增殖和表型恶性转化。研究表明有30％的乳腺癌患者Her2基因过度表达，这类患者肿瘤恶性程度高、复发和转移发生早、预后差，对某些化疗药物有抵抗，并且发现HER2基因过度表达与患者的无病生存和总的生存期有关。将肿瘤的生物标志物作为肿瘤治疗反应的重要预测指标是肿瘤生物学研究的主要目的之一。

单克隆抗体通过HER2下调来调节肿瘤生长，单克隆抗体——曲妥珠单抗trastuzumab(Herceptin)能直接选择性的对抗HER-2/neu蛋白，从而抑制肿瘤的生长，它具有高度亲和力，高度靶向性，只对癌细胞起作用，而对正常细胞的杀伤较小，是当代乳腺癌靶向治疗的代表性药物。适用于Her2过表达的乳腺癌及胃癌患者。在一个临床I期研究中，45例HER2过表达的转移性乳腺癌患者，用Herceptin是安全的，有客观反应的为11.6％，疾病稳定为37％。自2010年，欧洲和美国先后批准化疗联合使用曲妥珠单抗治疗HER2阳性胃及胃食管交界癌患者。准确的胃癌Her2表达和基因扩增检测结果是进展期胃癌Her2靶向治疗患者筛选和疗效预测的前提。但是，曲妥珠单抗治疗的绝对必要条件是Her2的过表达(阳性状态)。

可用于本发明的Her2基因来源于哺乳动物，较佳地来源于大鼠、小鼠、 或人。例如，优选的Her2基因的Genbank ID为2064。

引物和探针

如本文所用，术语“扩增Her2基因的引物”、“本发明引物”是指这样的引物(对)，其扩增出的扩增产物具有Her2的互补链序列。

经过大量引物(对)的筛选，本发明人发明，如SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示的引物对能够高效地扩增出Her2基因序列，且所扩增出的产物条带清晰无弥散。

为了进一步有效测定所扩增的产物，本发明人设计了一系列Her2基因的荧光检测探针，例如SEQ ID NO.:7(TATGCCCTGGCCGTGCTAGACAAT)所示，并最终筛选获得了高特异性、高敏感性的分子探针，其序列如SEQ ID NO.:3所示，本发明探针由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成。优选地，所述检测探针的5’端标记FAM荧光基团，且检测探针的3’端标记MGB荧光淬灭基团。

将SEQ ID NO.:1-2所示的引物以及SEQ ID NO.:3所示的探针应用于Her2基因的拷贝数检测，可以发现，对比引物+探针组合无法获得结果或结果特异性差，而本发明引物和探针组合则能够灵敏地、高特异性地检测出Her2的结果。

可用于本发明对照基因的特异性引物对序列如SEQ ID NO.:4(正向GCTGATGATCATAAAGCCACAGGTA)和SEQ ID NO.:5(反向TGGTGCTCAGGCAGTGC)所示；和/或所述特异性检测探针序列如SEQ ID NO.:6(TGCTGCAATAGGCGG)所示。

分析计算

由于在临床诊断中需要判断Her2的过表达，本领域技术人员通常需要采用Her2/CEP17的相对的量，因此，本发明还可优选采用CEP17作为对照(内参)基因，从而判断目标基因是否产生扩增。

例如Her2基因拷贝数标记为Ct-1，CEP17基因拷贝数标记为Ct-2，本发明通过计算ΔΔCt值判断Her2基因拷贝数，从而判断胃癌中Her2阳性样本。ΔΔCt＝ΔCt(胃癌样本)-ΔCt(对照样本)；ΔCt(胃癌样本)＝Ct-2(胃癌样本)-Ct-1(胃癌样本)；ΔCt(对照样本)＝Ct-2(对照样本)-Ct-1(对照样本)(如图2所示)。ΔΔCt<0则判断为Her2表达为阴性；而ΔΔCt>0则判断 为Her2表达阳性。

试剂盒

本发明提供了一种Her2基因检测试剂盒，所述的试剂盒含有容器，以及分别位于容器内的：

Her2基因特异性引物对，所述的特异性引物对如SEQ ID NO.:1(正向ACAACCAAGTGAGGCAGGTC)和SEQ ID NO.:2(反向GTATTGTTCAGCGGGTCTCC)所示；和

Her2基因特异性检测探针，Her2基因特异性探针序列如SEQ ID NO.:3(CCCAGCTCTTTGAGGACAAC)所示。

优选地，本发明还含有还含有对照基因的特异性引物对和特异性检测探针；一种优选的对照基因的特异性引物对序列如SEQ ID NO.:4(正向GCTGATGATCATAAAGCCACAGGTA)和SEQ ID NO.:5(反向TGGTGCTCAGGCAGTGC)所示；和/或所述特异性检测探针序列如SEQ ID NO.:6(TGCTGCAATAGGCGG)所示。

本发明试剂盒中探针和引物的浓度没有特别限制，可以由本领域技术人员根据所需的扩增效率进行决定。优选地，本发明Her2基因特异性引物的浓度为2.5-8uM/ul，优选为3-5uM/ul，例如4.5uM/ul，本发明Her2基因特异性探针的浓度为0.5-5uM/ul，优选为1-2uM/ul。

检测方法

本发明提供了一种非诊断性/诊断性的检测样本中Her2基因相对拷贝数方法，包括步骤：

(i)提供一反应体系，所述反应体系含有Her2基因的特异性引物对和特异性探针、以及对照基因的特异性引物对和对照基因；

(ii)利用(i)中的反应体系对Her2基因和对照基因进行PCR扩增；

(iii)分别测定所述Her2基因和对照基因的特异性探针发出的荧光信号，从而检测Her2基因相对于对照基因的相对拷贝数；

其中，所述的Her2特异性探针如SEQ ID NO.:1所示；所述的Her2基因特异性引物对如SEQ ID NO.:2(Fw)和SEQ ID NO.:3(Rv)所示。

可用于本发明的对照基因没有特殊限制，优选为常规采用的Cep17(17号染色体着丝粒序列)作为对照基因。当然，本领域技术人员也可以选择其他较 少产生多体的基因序列，如Her2基因相同染色体的其他基因序列作为参照。优选的测定对照基因(Cep17)的特异性引物对如SEQ ID NO.:4-5所示，特异性探针如SEQ ID NO.:6所示。

本发明的检测方法适用于荧光定量PCR，当然也可采用步骤(i)和步骤(ii)，并采用常规PCR扩增产物的验证方法进行定性检测。

可用于本发明的PCR扩增反应条件没有特殊限制，可以为本领域常规的PCR反应条件，优选地，所述的PCR扩增反应条件如下：

95℃10分钟；92℃15秒，60℃60秒，40个循环。

可用于本发明的样本包括组织样本、或血液样本。

在另一优选例中，所述的组织样本包括肿瘤组织、或癌旁组织。

在另一优选例中，所述的肿瘤组织包括胃癌组织、乳腺癌组织、结直肠癌组织。

本发明的有益效果

本发明就荧光定量PCR仪检测Her2受体基因拷贝数的特点，设计并筛选了大量引物和探针的组合后发现，当采用本发明引物和探针能够高效、高特异性地扩增出Her2基因，扩增产物清晰，且其检测获得的荧光信号准确无干扰，将其应用于临床的诊断后，与现有技术的吻合度更高，且价格低廉、可重复性高，使病理检测的准确性得到加强，并能大大降低医疗成本和费用，减少医疗资源的浪费。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1样本的收集和信息分析

本研究样品为2011年至2013年期间，长征医院收集所得存档的石蜡样本，常温保存。所有样品收集经过个人同意，并根据医院的伦理委员会批准协议，病理诊断结果经两名以上病理医师确认。所有病例均为腺癌，肿瘤组织或粘膜组织占到样本的85％以上，病理诊断结果经两名以上病理医师确认。患者临床 资料包括发病年龄、性别、肿瘤部位、淋巴结转移、浸润深度、组织分化和肿瘤TNM分期(AJCC第七版)等。

总共121例样品，包括120例胃癌样本，1例正常对照胃组织。手术样本为将肿瘤组织从病人身体中移除放入液氮并存储于-80℃，后经长征医院肿瘤科制备成存档的石蜡样本(FFPE样本)。

实施例2 DNA抽提

样品分别通过等试剂盒进行DNA抽提(Qiagen公司)，本发明中，样品使用新鲜切取的石蜡包埋组织，取10um厚度，16mm见方(面积约250mm²)的切片5-8片，去除组织周围多余石蜡。剩余的组织常温保存。

切取的碎片，参照Deparaffinization solution(Qiagen，19093)说明书先对石蜡样本进行脱蜡；随后再参照QIAamp DNA FFPE Tissue kit(Qiagen，56404)抽提DNA。用紫外分光光度法测定OD260nm和OD280nm，计算DNA浓度。-20℃保存。

实施例3引物的筛选

筛选获得多对备选引物，如SEQ ID NO.:8-9所示(Fw：5′-CCC AAC CAG GCG CAG AT-3′；Re：5′-AGG GAT CCA GAT GCC CTT GTA-3′)，但是以SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示的引物所扩增的产物条带最为清晰无弥散。

实施例4荧光定量PCR检测

4.1实验例

配置4.5uM/ul的Her2基因PCR反应原液(各4.5uM上游引物SEQ ID NO.:1和下游引物SEQ ID NO.:2、1uM探针SEQ ID NO.:3)和4.5uM/ul的CEP17基因PCR反应原液(各4.5uM上游引物和下游引物、1uM探针)各100ul备用。

按比例吸取相应量的Her2基因PCR反应液、CEP17基因PCR反应液、Taq酶(Her2基因PCR反应液和CEP17基因PCR反应液各取2ul/人份，Taqman反应2x MasterMix预混液5ul/人份)，将前述步骤得到的混合液充分混匀后按9ul/人份使用12道连续移液器将混合液逐行分别加入384孔PCR反应管，每孔9ul，备用。

分别向加入了Her2基因PCR反应液、CEP17基因PCR反应液和Taq酶混合 液的反应孔加样，加入1ul提取的胃癌FFPE组织DNA，同时分别加入1ul正常胃组织样本，以及加入1ul双蒸水作为NTC，完毕后检查每个孔液体量是否均一。

使用定量封板膜(ABI，4711971)封板后颠倒混匀，室温1000g离心1分钟。放入定量PCR仪中(ABI，7900Ht Fast)做定量PCR。程序为：95℃10分钟；后运行92℃15秒，60℃60秒，40个循环。Her基因选用FAM标记的Taqman探针进行检测，选择Reporter为FAM和Quencher为MGB，同时用CEP17基因作为参照，探针选用VIC标记的探针进行检测，再选择Reporter为VIC和Quencher为MGB的荧光信号。收集数据，进行生物信息学分析。

4.2对照例

采用4.1相同方法，区别在于采用其他设计探针，其中之一的序列如SEQ ID NO.:7所示。

实施例5检测结果计算分析

5.1 Her2基因拷贝数检测

检测样品通过ABI分析软件，使用Automatic baseline，并设置Manual ct的Threshold为0.2。然后对4.1和4.2的方法进行分析结果。每个样品均有两个复孔，因此计算平均Ct值。Her2基因拷贝数标记为Ct-1，CEP17基因拷贝数标记为Ct-2，本发明通过计算ΔΔCt值判断Her2基因拷贝数，从而判断胃癌中Her2阳性样本。ΔΔCt＝ΔCt(胃癌样本)-ΔCt(对照样本)；ΔCt(胃癌样本)＝Ct-2(胃癌样本)-Ct-1(胃癌样本)；ΔCt(对照样本)＝Ct-2(对照样本)-Ct-1(对照样本)(如图2所示)。ΔΔCt<0则判断为Her2表达为阴性；而ΔΔCt>0则判断为Her2表达阳性。

结果可见，采用4.1的方法对Her2基因拷贝数检测计算所得，Her2阳性表达样本为51例。而4.2则如图3B所示，基于荧光定量PCR检测Her2基因扩增效率低。

5.2 FISH与Her2基因拷贝数比较

120例胃癌组织样本的Her2表达通过荧光原位杂交(FISH)法和荧光定量PCR检测Her2基因拷贝数法比较结果发现，FISH法检测发现其中59例为Her2阳性表达样本，61例为Her2阴性表达样本。

5.1的结果中符合FISH法检测的Her2阳性标本为46例，符合度为77.97％，而Her2阴性表达样本为69例，符合FISH法检测的标本为56例，符合度达到了91.8％。符合FISH法检测的总样本数位102例，符合度为85％(见表1)。

表1：FISH法与荧光定量PCR检测Her2基因拷贝数比较结果。

5.3 IHC与Her2基因拷贝数比较

120例胃癌组织样本通过IHC法分析时在本发明中去除了5例胃镜检查与手术后检查不符合样本，共计115例。其中，Her2表达通过免疫组织化学(IHC)法检测发现，其中阴性样本共计63例(包括IHC＝0有50例，IHC＝1有13例)；IHC法检测不确定样本(IHC＝2)为26例；确定阳性样本(IHC＝3)为26例。

而通过荧光定量PCR检测Her2基因拷贝数的方法发现，阴性样本共计53例(IHC＝0有45例，符合度达到90％；IHC＝1有8例，符合度为61.5％)；而阳性样本检测结果和IHC法与FISH法均一样为26例，符合度为100％。如表2所示，符合IHC法检测的样品共计78例，符合度为89.7％，高于IHC法与FISH法的78％。

表2：IHC法和FISH法以及荧光定量PCR检测Her2基因拷贝数比较结果。

目前FDA认可的筛选Her2基因扩增的乳腺癌或者胃癌患者的方法主要还是IHC法和FISH法，一般采用免疫组织化学的方法检测Her2蛋白过表达，应用荧光原位杂交法检测Her2基因扩增水平。因此本发明的结果通过对比两种方法，本发明可以作为检测胃癌中Her2基因拷贝数扩增与否的一个有效补充。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。