本申请是原申请的申请日为2012年9月28日，申请号为201280058049.1，发明名称为《用于治疗艰难梭菌感染的药物化合物》的中国专利申请的分案申请。本发明涉及艰难梭菌毒素的肠溶活化剂，尤其是六元环多元醇的聚磷酸盐衍生物、聚硫酸盐衍生物或混合的聚磷酸盐/硫酸盐衍生物。艰难梭菌是革兰氏阳性菌的一种，其在人类患者中引起严重的腹泻。艰难梭菌感染(CDI)通常影响抗生素治疗中的患者，因为该细菌仅能够在耗尽细菌群落的患者的结肠内繁殖(colonize)。由于最近北美及欧洲地区的疾病爆发带来新的更强毒性菌株的传播，艰难梭菌的耐抗生素菌株的出现引发越来越严重的发病率和死亡率。艰难梭菌无症状地繁殖于2-5％的成年人中。细菌形成孢子，其难以用一般的杀菌方法中和(neutralize)。结果，艰难梭菌感染成为延长住院的常见结果；在美国，该病菌被认为是与医院相关的腹泻的主要原因。目前的治疗选择是口服甲硝唑(metronidazole)，或者在前者失效的情况下，口服万古霉素(vancomycin)。由于CDI的临床症状是由结肠中艰难梭菌分泌的两种有毒蛋白而非该细菌本身的存在所引起，近期做出多种努力以靶向这些毒素(例如使用高分子粘合剂)，但迄今在临床试验中仍未成功。艰难梭菌肠毒素(毒素A,TcdA)和细胞毒素(毒素B,TcdB)是导致所述疾病症状的主要原因(foratoxinbiologyreview(出于毒素生物学回顾),参见VothandBallard,ClinicalMicrobiologyReviews2005,18,247-263)。简言之，这两种毒素由四个结构域组成，第一结构域介导该毒素与细胞的连接，第二结构域促进易位至胞液(cytosol)中，第三结构域通过自溶引发该毒素结构域裂解，以及最后的毒素结构域或“弹头(warhead)”本身，引发毒素在受感染细胞中的生理效应。Reineke等人(Nature2007,446,415)确定肌醇己糖磷酸(myo-inositolhexakisphosphate)(IP6)为细胞胞液中TcdA/TcdB自加工的天然触发剂。Egerer等人(PLoSPathog.2010,6,e1000942)和Shen等人(Nat.Struct.Mol.Biol.2011,18,364)建议靶向IP6-诱导的自加工机制作为对抗毒素-介导的病原性的治疗性干预手段。Kreimeyer等人建议药学上使用IP6来干预CDI(Naunyn-Schmiedeberg'sArch.Pharmacol.2011,383,253)。然而，由于结肠中存在的高钙浓度会沉淀IP6并阻止其有效，因此该方法不可行。因此，本发明的目的是为患有CDI的患者提供改进的治疗选择。该目的通过独立权利要求的主题来实现。定义本发明上下文中的术语“烷基”或“烷基基团”表示饱和的烃部分，其可以是直链、支链、环状或带有直链或支链侧链的环状。术语“烷基”包括部分不饱和烃，如丙烯基。实例是甲基、乙基、正丁基或异丁基、正己基或环己基。术语“烷基”可扩展至通过杂原子连接或桥接的烷基基团。本发明上下文中的杂原子是氮(N)、硫(S)和氧(O)。本发明上下文中的C1-C3烷基表示饱和的直链或支链烃，其具有1、2或3个碳原子，其中一个碳碳键可以是不饱和的，且一个CH2部分可以换成氧(醚桥)。C1-C3烷基的非限制性实例是甲基、乙基、丙基、丙-2-烯基和丙-2-炔基。本发明上下文中的C1-C5烷基表示饱和的直链或支链烃，其具有1、2、3、4或5个碳原子，其中一个或两个碳碳键可以是不饱和的，且一个CH2部分可以换成氧(醚桥)。C1-C5烷基的非限制实例包括以上给出的C1-C3烷基的实例，以及额外的正丁基、2-甲基丙基、叔丁基、3-甲基丁-2-烯基、2-甲基-丁-3-烯基、3-甲基丁-3-烯基、正戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、丁-3-烯基、丁-3-炔基和戊-4-炔基。本发明上下文中的C3-C10烷基表示饱和的直链或支链烃，其具有3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子，其中1、2或3个碳碳键可以是不饱和的，且一个CH2部分可以换成氧(醚桥)。本发明上下文中的单糖表示包含3、4、5、6或7个碳原子的糖。实例是甘油醛(C3)，赤藓糖或苏阿糖(C4)，树胶醛糖、核糖或木糖(C5)，葡萄糖、甘露糖、半乳糖或果糖(C6)或景天庚酮糖(C7)。C3、C4、C5、C6和C7单糖的糖醇和氨基糖包括在本文定义的单糖的组中。低聚糖是由2-10个相同或不同的上述定义的单糖组成的分子。多聚糖包含10个以上单糖。给定组的单体的聚合物是均聚物(由多个相同单体组成)；给定选择的单体的共聚物是由该组的至少两种单体组成的杂聚物。本发明基于IP6的小分子类似物(analogue)的新构思，其被用于口服治疗以引发结肠内腔中毒素的裂解，由此在其到达目标前使弹头分离，并使其无害。由于IP6因其在结肠内腔中存在的高钙浓度下不可溶而使其本身不能用于该目的，因此本发明提供了具有改进溶解性的IP6的新类似物。根据本发明第一方面，提供了特征为通式(1)的药物化合物，其中R1是或包含选自以下组的溶解官能团R2，所述组包括：聚乙二醇；单糖，低聚糖或多聚糖；聚甘油，例如式((R3-O-(CH2-CHOH-CH2O)n-)描述的聚甘油，其中R3为氢、甲基或乙基，且n具有3-200的值，或支链或超支化的聚甘油，如式(R3-O-(CH2-CHOR5-CH2-O)n-)描述的，其中R5为氢或甘油链，且R3为氢、甲基或乙基；包含多个任意的单体甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、乙烯醇(VA)、乙烯基吡咯烷酮(VP)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)和/或PEG甲基丙烯酸酯(PEGMA)的聚合物或共聚物，其中n和m独立地具有3-200的值；聚(苯乙烯-共-马来酸/酸酐)；包含至少三个取代基官能团的C3-C10烷基，所述官能团独立地选自包括胺-、羟基-、巯基-、羧酸、羧基酰胺(carboxylicamide)、磺酸或磺胺官能团的组；以及每一个X独立地选自OPO32-、OPSO22-或OSO3-，Z是包含1-3个碳原子和/或杂原子的烷基链，其可选地包含基团X，其中X如上所定义。胺官能团是指官能团NR'R\，其中R'和R\独立地选自氢和C1-C5烷基。在一些实施方案中，R'和R\选自氢和C1-C3烷基。羟基官能团是OH。巯基官能团是SH。羧酸官能团是COOH或其阴离子COO-。羧基酰胺是CONR'R\，其中R'和R\独立地具有如上所示的定义。磺酸是SO3H。磺酸胺是SO2NR'R\，其中R'和R\独立地具有如上所示的定义。在一些实施方案中，所述聚乙二醇如式(R3-(O-CH2-CH2)n-)所示，其中R3为氢、甲基或乙基，且n具有3-200的值。在一些实施方案中，n具有3-20的值。在一些实施方案中，n具有10-30的值。在一些实施方案中，n具有9-45的值。在一些实施方案中，所述聚乙二醇是支链聚乙二醇。在一些实施方案中，R1包含醚、硫醚、羧酸酯、胺、羧基酰胺、尿素、磺胺、磷酰胺、磷酸酯、硫代磷酸酯(phosphorothioate)、烷基、三唑或氨基甲酸酯官能团、或前述任意基团的组合，其将R2与分子连接。在一些实施方案中，R1是CH2、CH2CH2、CHX、CHX-CH2、CH2CHX、CHX-CHX、CH2-O或将R2与分子连接的CHX-O基团。在一些实施方案中，式(1)描述了五元、六元或七元烷基环，且R1共价连接至形成该环的其中一个碳原子上。在一些实施方案中，R1连接至形成该环的CH基团上。根据另一实施方案，R1连接至形成该环的CX基团上(也就是说，碳环可以用CXR1表示，其中X和R1具有如上所示的定义)。在一些实施方案中，R2是含有3、4、5、6、7或8个取代基官能团的C3、C4、C5、C6、C7或C8烷基基团，所述取代基官能团独立地选自包括胺-、羟基-、巯基-、羧酸、羧基酰胺、磺酸或磺胺官能团的组。在一些实施方案中，R2是式((R3-O-(CH2-CHOH-CH2O)n-)描述的聚甘油，其中R3为氢、甲基或乙基，且n具有3-200的值。在这些实施方案的一些可替代方案中，n具有3-20的值。在这些实施方案的一些可替代方案中，n具有10-30的值。在这些实施方案的一些可替代方案中，n具有9-45的值。在一些实施方案中，R2是式(R3-O-(CH2-CHOR5-CH2-O)n-)描述的聚甘油，其中R5为氢，或式(R3-O-(CH2-CHOH-CH2-O)n-)描述的直链甘油链，且R3为氢、甲基或乙基。在一些实施方案中，R2是式(R3-O-(CH2-CHOR5-CH2-O)n-)描述的超支化的聚甘油，其中R5为氢，或式(R3-O-(CH2-CHOR6-CH2-O)n-)描述的甘油链，其中R6为氢，或式(R3-O-(CH2-CHOR7-CH2-O)n-)描述的甘油链，其中R7为氢，或式(R3-O-(CH2-CHOH-CH2-O)n-)描述的直链甘油链，且R3为氢、甲基或乙基。超支化的甘油及其合成方法描述于Oudshorn等人，Biomaterials(2006),27,5471-5479；Wilms等人,Acc.Chem.Res.(2010)43,129-41，以及其中引用的文献中。在一些实施方案中，R2是包含多个任意的单体甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、乙烯醇(VA)、乙烯基吡咯烷酮(VP)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)和/或PEG甲基丙烯酸酯(PEGMA)的聚合物或共聚物，其中n具有3-200的值，且m具有3-200的值。在这些实施方案的一些替代方案中，n具有3-20的值，且m具有3-200的值。在这些实施方案的一些替代方案中，n具有10-30的值，且m具有3-200的值。在这些实施方案的一些替代方案中，n具有20-50的值，且m具有3-200的值。在这些实施方案的一些替代方案中，n具有3-200的值，且m具有3-20的值。在这些实施方案的一些替代方案中，n具有3-200的值，且m具有10-30的值。在这些实施方案的一些替代方案中，n具有3-200的值，且m具有20-50的值。在其中溶解官能团直接连接至化合物的实施方案中，R1等于(是)R2。在一些实施方案中，Z是CH2、CHX、CHR、CXR1、CH2-CH2、CH2-CHX、CHX-CHX、CHR1-CHX、CXR1-CHX、CHR1-CH2、CXR1-CH2、CHR1-CHOH、CH2-CH2-CH2、CH2-O-CH2、CHOH-CH2-CH2、CHOH-CHOH-CHR1、CHOH-CHR1-CHOH、CHX-CH2-CH2、CH2-CHX-CH2、CHX-CHX-CH2、CHX-CH2-CHX或CHX-CHR-CHX。溶解官能团提供分子在存在10mmol/lCa2+的水溶液中的可溶性。本发明的分子在钙浓度高于1mmol/l的情况下的溶解度大于IP6。根据一个优选实施方案，本发明的分子的溶解度大于10μmol/l。在一些实施方案中，本发明的药物化合物用式(2)表示，其中X和R1具有以上概括的定义。在一些实施方案中，化合物用式(3)表示，其中X和R1具有以上概括的定义：在一些实施方案中，本发明的化合物包含五元-七元环，其中至少四个环成员可以由式CH-X表示，且一个环成员可以由式Y-R1表示，其中Y为CH或N，且R1和每个X独立地具有如上限定的含义。在一些实施方案中，仅有一个环成员可以由式Y-R1表示。在一些实施方案中，本发明的化合物具有五元环结构，其中四个环成员由式CH-X表示，且一个环成员由式Y-R1表示，其中X、Y和R1如上所限定。在一些实施方案中，本发明的化合物具有六元环结构，其中五个环成员由式CH-X表示，且一个环成员由式Y-R1表示，其中X、Y和R1如上所限定。在一些实施方案中，本发明的化合物具有七元环结构，其中六个环成员由CH-X表示，且一个环成员由式Y-R1表示，其中X、Y和R1如上所限定。在一些实施方案中，本发明的化合物如式(4)所述。在一些实施方案中，其由式(5)或式(6)所述。在一些实施方案中，本发明的这种环状分子可以由下式表示：其中每个X(独立地)、Y和R1具有如上所限定的含义。在一个实施方案中，式(6)包含作为溶解官能团的聚(乙二醇)PEG400，其中R1为CH3(OCH2-CH2)9-O-:肌醇-戊糖磷酸-2-PEG(400)(7)是肌醇-己糖磷酸的PEG400-类似物。式(7)已证明了在钙存在下具有改善的裂解TcdBCPD的能力。另一实施方案涉及(7)的PEG2000类似物，即具有大约45个乙二醇单体的PEG。另一实施方案涉及如式8表示的鲨肌醇己糖磷酸(scyllo-inositolhexakisphosphate)的类似物，其中R1具有如上概括的含义。在一些实施方案中，本发明的化合物可由式(8)表示，且R1是聚(乙二醇)部分。溶解官能团与分子连接，使得其在结肠内腔中存在钙浓度下可溶。溶解官能团的一个非限制实例为此处所示的聚(乙二醇)(PEG)链。根据本发明的第二方面，提供肌醇己糖硫酸(inositolhexakissulfate)(肌醇己基硫酸；IS6)用于治疗或预防CDI。特别优选的实施方案是肌醇-(11)或鲨肌醇己糖硫酸(12)尽管在结构和电荷密度方面与IP6具有可比性，但是本发明惊人地显示出，在钙的存在下，IS6比IP6活跃得多(参见图4)。肌醇己糖硫酸可通过商业获得(CASNo.28434-25-5；interalia,SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA,USA)。根据本发明的第三方面，提供了用式(15)表示的药物化合物，其中每个X独立地选自OPO32-、OPSO22或OSO3-，条件是并非所有的X为OPO32-且并非所有的X为OSO3-。根据本发明的第四方面，提供在前述段中用式(15)表示的化合物用作药物，尤其是用于预防或治疗艰难梭菌感染。在一些实施方案中，本发明的第三方面的化合物用式(15a)或(15b)表示，其中X具有如上概括的含义：在一些实施方案中，本发明的第三方面的化合物用式(16a)或(16b)表示，其中，a)X2是OSO3-，且X1、X3、X4、X5和X6独立地选自OPO32-、OPSO22-或OSO3-；b)X1、X3和X5为OPO32-，且X2、X4和X6为OSO3-(化合物16a-b或16b-b)，c)X1、X3和X5为OSO3-，且X2、X4和X6为OPO32-(化合物16a-c或16b-c),d)X4、X5和X6为OSO3-，且X1、X2和X3为OPO32-(化合物16a-d或16b-d),e)X4、X5和X6为OPO32-，且X1、X2和X3为OSO3-(化合物16a-e或16b-e),f)X2和X5为OPO32-，且X1、X3、X4、和X6为OSO3-(化合物16a-f或16b-f),g)X2和X5为OSO3-，且X1、X3、X4和X6为OPO32-(化合物16a-g或16b-g),h)X2和X3是OPO32-，且X1、X4、X5和X6为OSO3-(化合物16a-h或16b-h)，或i)X2和X3为OSO3-，且X1、X4、X5和X6为OPO32-(化合物16a-i或16b-i)。可以按照标准方法合成如上所限定的化合物。在本发明的实施例中描述了化合物16a-b的合成。根据本发明的另一方面，提供本发明的上述任意方面的以最广泛的定义给出的化合物或在任意实施方案中给定的化合物，用作药物。根据本发明的又一方面，提供本发明的上述任意方面的以最广泛的定义给出的化合物或在任意实施方案中给定的化合物，用于治疗或预防艰难梭菌感染。可以将本发明的化合物给药至已诊断有CDI的患者，或者疑似患有CDI的患者。或者，该化合物可以用作处于感染风险的患者的预防药，如医院环境中抗生素治疗下的患者。本发明的化合物易于合成，耐胃肠道降解并且不太可能被吸收进入血流，因而避免了潜在的副作用。本发明的化合物不需要渗入哺乳动物细胞膜或细菌膜来使其起作用，这使得其在体内更有效。此外，本发明的化合物不太可能对细菌产生选择性压力，因此避免了与抗性有关的问题。根据本发明的又一方面，提供了用于预防或治疗艰难梭菌感染的方法中的药物组合物，其包含本发明上述任意方面的化合物。优选的药物组合物包含约1％至约95％的活性成分，优选约20％至约90％的活性成分。本发明上述方面的药物组合物可以单独施用或者与一种或多种其他治疗剂联合施用。联合治疗可以采用本发明的化合物和一种或多种其他抗生素成分的固定组合的形式。施用可以交错进行，或者药物可以彼此独立或作为固定组合施用。根据一个优选实施方案，药物组合物包含本发明的上述任意方面的化合物，以及额外地包含甲硝唑、万古霉素和/或非达霉素(fidaxomicin)。根据本发明的又一方面，提供包含本发明的上述任意方面的化合物的剂型。优选口服剂型，尤其是片剂、糖浆剂、溶液剂、胶囊剂或粉剂。根据一个优选实施方案，这样的剂型还包含抗生素活性化合物，如(以非限制性实例的方式)甲硝唑、万古霉素和/或非达霉素。根据本发明的又一方面，提供了用于预防和治疗CDI的治疗方案，其包括施用本发明的化合物。施用可以通过本文描述的任一种方法来进行。本发明范围内还包括一种用于预防或治疗CDI的方法，其包括向有需要的个体施用本发明的化合物。同样，提供本发明的化合物用于制备预防或治疗CDI的药物。本发明的药物可通过本领域中已知的方法制备，尤其是通过常见的混合、包覆、成粒、溶解或冻干来制备。尽管对于单独的特征如R1、R2、X等的可选项以“实施方案”列于本文中，应理解可以自由组合这些可选项以形成所提供的或用于本文的方法或医学指征中的整个分子的独立的实施方案。因此，可以将R1的任何可选择的实施方案与Z的任何可选择的实施方案或本文提及的所述式中的任意的环结构相组合。附图简要说明图1显示在体内存在活化剂化合物(7)(空心圆圈)或IP6的情况下TcdB半胱氨酸蛋白酶结构域依浓度的裂解(1A)；以及在10mMCa2+中对应的动力学(1B)。图2显示在存在活化剂化合物(7)(空心圆圈)、其PEG2000类似物(空心三角形)及其甲基类似物(黑方块)的情况下TcdB半胱氨酸蛋白酶结构域依浓度的裂解。图3显示化合物7的合成。图4显示在用于活化剂化合物(11)的10mMCa2+的存在下TcdB半胱氨酸蛋白酶结构域依浓度的裂解；活化剂数据用空心圆圈表示；IP6对照用黑方块表示。图5显示化合物(16a-b)的合成。图6显示在用于活化剂化合物(16a-b)的10mMCa2+的存在下TcdB半胱氨酸蛋白酶结构域依浓度的裂解。实施例1.化合物(7)的合成按照图3描述的顺序进行合成。化合物B：向氢化钠(4.3mmol,103.7mg)在10mL二甲基甲酰胺(DMF)中的悬浮液中逐滴加入化合物A[Martin,S.F.etal.,J.Org.Chem.1994,59,4805](2.16mmol,1363mg)在DMF(10mL)中的溶液。加入完成后，室温下搅拌该混合物30min(分钟)，之后加入MeO-PEG-OTs(OTs为甲苯磺酸盐)(3.2mmol,1.64g在10mLDMF中)。使反应搅拌过夜，然后用水(5mL)淬火。用二氯甲烷(DCM)萃取该混合物。蒸发溶剂，并将残余物在硅胶上用六份100mL的乙酸乙酯：己烷进行层析，所述六份乙酸乙酯：己烷分别为20:80；30:70；40:60；60:40；80:20；100:0。层析导致包括平均值为9PEG单位的化合物B的具有不同PEG尺寸的产物分级。1HNMR(400MHz；CDCl3):δ7.29-7.13(m,25H),4.83(d,J＝10.8Hz,2H),4.79(s,2H),4.74(d,J＝10.8Hz,2H),4.63(d,J＝11.7Hz,2H),4.59(d,J＝11.6Hz,2H),3.97-3.88(m,5H),3.64-3.42(m,31H),3.38(t,J＝9.2Hz,1H),3.29-3.25(m,5H)。化合物C：将化合物B溶于四氢呋喃(THF，4mL)、甲醇(7mL)和水(3mL)的混合物中，之后加入过量的10％钯碳(palladiumoncharcoal)。将混合物置于氢气氛下并在室温下搅拌过夜。然后用氮气净化该反应混合物，过滤并蒸发溶剂。然后通过用10mL水洗脱在反相盒(reversephasecartridge)(Sep-Pak,Waters,1g,C18,Cat.#WAT036905)上纯化该粗混合物。冻干所有馏分(1.5ml)并通过1HNMR解析来分析。1HNMR(400MHz；D2O):δ3.96-3.94(m,2H),3.89(t,J＝2.8Hz,1H),3.78-3.69(m,28H),3.69-3.60(m,5H),3.56(dd,J＝10.0,2.8Hz,2H),3.40(s,3H),3.25(t,J＝9.2Hz,1H)。化合物D：将化合物C(0.2mmol,119mg)悬浮在四唑(3.630mmol,8.1mL,0.45M在CH3CN中)和DCM(10mL)中，然后加入N,N-二乙基-1,5-二氢-2,4,3-苯并二氧磷杂七环-3-胺(1.8mmol,434mg)并在室温下搅拌该混合物过夜。然后将混合物冷却至-10℃，加入间氯过氧苯甲酸(mCPBA,用Na2SO4预干燥，4.8mmol,1189mg)在DCM(2mL)中的溶液。使该混合物在-10℃额外搅拌10min(分钟)，然后使其恢复室温并搅拌1小时。用稀释的亚硫酸钠清洗混合物并用DCM萃取。用Na2SO4干燥有机层，过滤并浓缩。用1-5％梯度的甲醇在DCM中于硅胶上层析该残余物。1HNMR(400MHz；CDCl3):δ7.41-7.27(m,18H),7.21(dd,J＝6.9,1.7Hz,2H),5.59-5.51(m,6H),5.44(t,J＝14.2Hz,2H),5.37-5.29(m,6H),5.25-4.95(m,10H),4.74(ddd,J＝9.9,7.6,2.1Hz,2H),4.61(t,J＝2.2Hz,1H),4.03(t,J＝4.9Hz,2H),3.68-3.50(m,22H),3.48(dd,J＝6.1,4.0Hz,2H),3.40-3.34(m,7H).13CNMR(101MHz；CDCl3):δ135.78,135.72,135.4,135.14,134.99,129.38,129.27,129.26,129.22,129.14,129.11,128.96,128.95,77.6,76.05,76.01,73.8,71.9,70.67,70.60,70.57,70.54,70.53,70.49,70.38,70.34,70.29,69.46,69.39,69.33,69.24,69.16,69.01,68.95,59.0。化合物(7)：将化合物D溶解在THF(1mL)、甲醇(1.5mL)和水(2mL)的混合物中，之后加入过量的10％钯碳，将混合物置于氢气氛下并在室温下搅拌过夜。然后用氮气净化该混合物，过滤并浓缩。通过加入稀释的NaOH水溶液(170μl,0.1M)使得化合物的pH为7。通过用10ml水洗脱在葡聚糖凝胶柱(PD-10,GEHealthcare,SephadexG-25M,cat.#17-0851-01)上纯化残余物。冻干所有馏分(1.5mL)并通过1HNMR分析。通过用10ml水洗脱在反相盒(Sep-Pak,Waters,1g,C18,cat.#WAT036905)上进一步纯化含产物的馏分。冻干所有馏分(1.5ml)并通过1HNMR解析分析。1HNMR(400MHz；D2O):δ4.44(q,J＝9.4Hz,2H),4.20(s,1H),4.16-4.10(m,3H),4.06(t,J＝4.7Hz,2H),3.83-3.63(m,26H),3.40(s,3H).31PNMR(162MHz；D2O):δ1.5,1.2,0.8。2.在10mMCa2+存在下测定EC50在pH7.4的100mM三羟甲基氨基丙烷(Tris)中存在10mMCa2+的情况下，将待检测的化合物加入SEQID1的艰难梭菌毒素B的重组His-标记的半胱氨酸蛋白酶结构域中，并在37℃培养2h(小时)。通过SDS-PAGE分离裂解的蛋白片段并通过考马斯染色(Coomassiestaining)使其可视化。使用ImageJ软件包由蛋白谱带强度来定量裂解的程度。使信号标准化(normalized)，得到裂解的阳性对照和阴性对照。图1A示出对IP6和化合物(7)分析的结果。这些结果表明相似浓度的IP6和化合物(7)可达到毒素片段50％的裂解。在100μΜ时，IP6的活性几乎完全消失，而化合物(7)保留残余活性。化合物(7)的PEG链很可能赋予了该分子更宽窗口的溶解性。3.裂解动力学的比较在pH7.4的100mM三羟甲基氨基丙烷(Tris)中存在10mMCa2+的情况下，将待检测的化合物加入(具有以上给出的相同序列的)艰难梭菌毒素B的重组His-标记的半胱氨酸蛋白酶结构域中，并在37℃培养24h(小时)，每隔一定时间除去等份。如上所述，分离裂解的蛋白片段，使其可视化并分析。图1B示出对IP6和化合物(7)分析的结果。这些结果表明4小时后化合物(7)的裂解程度比IP6的高5倍。4.化合物(16a-b)的合成化合物F：氮气氛下用四唑在0.45m乙腈(20.0ml,9.0mmol,9eq.)和邻苯二甲基-N,N-二乙基亚磷酰胺(6mmol,1.44g,6eq.)中处理2,4,6-三-O-(4-甲氧苯甲醇)-肌-纤维醇(E)[D.Lampe,C.Liu,B.V.L.Potter,J.Med.Chem.1994,37,907](0.541g,1mmol,1eq.)在干CH2Cl2(20ml,0.05m)中的溶液。在室温下搅拌该反应混合物2天。-10℃下加入用Na2SO4干燥过的mCPBA(12mmol,2.07g,12eq.)的溶液，并在室温下额外搅拌该反应混合物45分钟。然后在EtOAc中稀释该混合物，用饱和的NaHCO3水溶液和盐水清洗。用Na2SO4干燥有机相，过滤并真空浓缩。通过急骤层析法(SiO2,CH2Cl2/MeOH逐步从0％至4％,三次)纯化，提供呈白色固体的2,4,6-三-O-(4-甲氧苯甲醇)-1,3,5-三-O-(邻苯二甲基磷)肌-纤维醇(F)(98％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.28-7.36(12H,m),7.19-7.22(2H,m),7.12-7.17(4H,m),6.86(2H,d,J8.5Hz),6.71(4H,d,J8.5Hz),5.25(1H,d,J13.6Hz),5.21(1H,d,J13.6Hz),5.15(1H,d,J13.7Hz),5.11(1H,d,J13.7Hz),4.91-5.08(8H,m),4.83-4.89(4H,m),4.69-4.61(3H,m),4.57(1H,q,J9.2Hz),4.38(2H,ddd,J2.4,8.1,9.5Hz),4.10(2H,t,J9.5Hz),3.78(3H,s),3.72(6H,s)；13CNMR(125MHz,CDCl3)δ(ppm)159.3,159.1,135.4,135.3,135.2,130.8,130.3,129.7,129.6,129.2,129.13,129.12,129.0,128.9,128.6,113.74,113.57,80.6(d,JCP6.0Hz),78.1(dd,JCP6.9,3.2Hz)77.6,77.1(m),76.0,74.9,68.8,68.70,68.68,68.62,68.34,68.28,55.4,55.3；31PNMR(160MHz,1H-解耦,CDCl3)δ(ppm)1.10,-1.32。化合物G:将化合物F(97mg,0.089mmol)溶于1mL二氯甲烷中。加入6mL三氟乙酸：水为5:1的混合物。搅拌25分钟然后用10mL甲苯稀释，并真空浓缩。用己烷和二氯甲烷研磨所得残余物，然后高真空下干燥。产生68mg直接用于下一步骤的粗化合物G。化合物H：将化合物G(39mg,0.054mmol)溶于3mLDMF中并加入SO3·Et3N(195mg,1.07mmol)。50℃下搅拌该溶液过夜，并于旋转蒸发仪上浓缩。将残余物溶于6mL水中，过滤并加载在三个Vac6cc1gtC18Sep-Pak容器(Waters，沃特斯)上。用0-40％MeOH/H2O的梯度洗脱柱。得到32mgH。1HNMR(400MHz；MeOD):δ7.45-7.40(m,4H),7.39-7.33(m,4H),7.28-7.24(m,2H),7.21-7.19(m,2H),5.69-5.60(m,4H),5.47(dd,J＝13.2,10.4Hz,2H),5.41(t,J＝2.9Hz,2H),5.40-5.35(m,2H),5.20-5.16(m,1H),5.11-4.97(m,5H),4.90-4.81(m,2H),3.24(q,J＝7.3Hz,17H),1.32(t,J＝7.3Hz,25H).13CNMR(101MHz；MeOD/CDCl3):δ131.6,131.2,125.26,125.21,125.09,124.93,124.87,124.78,70.25,70.22,70.19,69.95,69.90,65.18,65.11,65.07,65.00,64.85,64.78,42.4,4.2；31PNMR(162MHz；MeOD/CDCl3):δ-7.8,-8.9。化合物PSPSPS((16a)b)：将化合物H(32mg)溶于3mLH2O。加入一小勺载钯活性炭(10％)，将混合物置于H2气氛下并搅拌4小时。然后用N2净化混合物，并加入一滴NH4OH。通过硅藻土(celite)过滤混合物并于旋转蒸发仪上蒸发。将残余物溶于1mL水中，并加载在Vac6cc1gtC18Sep-Pak容器(沃特斯)上，并用水洗脱。冻干洗脱的级分并用1HNMR分析。得到16mgPSPSPS-2Et3NH+·xNH4+。1H-NMR(400MHz；D2O):δ4.93-4.78(m,3H),4.55-4.39(m,3H),3.13(q,J＝7.3Hz,14H),1.21(t,J＝7.3Hz,21H).31PNMR(162MHz；D2O):δ-0.3,-0.7。如实施例2所述，在钙的存在下测定由化合物PSPSPS((16a-b)诱导的裂解，且结果显示在图7中。在20μΜ浓度时，由该衍生物诱导的裂解为50％，其比IP6(601μΜ)更有效。该结果显示，一些硫酸盐基团的存在提高了钙存在下化合物的活性。