一种非化学溶剂提取申嗪霉素的方法与流程

本发明属于生物发酵提纯技术领域，尤其是涉及一种非化学溶剂提取申嗪霉素的方法。

背景技术：

申嗪霉素又名吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylicacid，pca)，是由荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)m18(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：cgmcc.no.0462，已在中国专利cn1141379c中公开)经有氧发酵而产生的一种次级代谢产物，属吩嗪类化合物，分子式c13h8n2o2，分子量224，在有机溶剂中的结晶纯品为黄色针状，熔点241～242℃，溶于醇、醚﹑乙酸乙酯﹑氯仿和苯等有机溶剂，微溶于水，在偏酸性及中性条件下稳定。荧光假单胞菌m18菌株是从甜瓜根际土壤中筛选出来，它的代谢产物pca能有效防治危害水稻﹑瓜果和蔬菜的多种真菌和细菌性病害，国内已登记的农药剂型有1％申嗪霉素悬浮剂。申嗪霉素具有对动物毒性低，保护生态环境，残留时间短等优点，是很有前景的微生物源绿色农药。

目前，工业化提取申嗪霉素的方法主要是采用经典的溶媒法提取工艺，即发酵液先预处理，然后经半框过滤，对滤液进行浓缩后，用乙酸乙酯或氯仿进行萃取，然后进行二次浓缩，再利用离心机进行离心分离，将滤液进行浓缩结晶，将晶体过滤后烘干，并过筛检验。此工艺的不足之处主要在于：

1.提取车间和提取设备必须是防火防爆设计，有安全风险。

2.萃取过程消耗大量的有机溶剂(乙酸乙酯或氯仿等)，污染环境。

3.浓缩和结晶工序需要制热和制冷系统配套，生产成本较大。

4.生产出来的申嗪霉素原药含少量残留有机溶剂。

现代生物农药的生产，非常重视绿色概念，生产过程和产品本身都要安全和环保，按上述经典工艺制造生物农药很难符合当代和未来的理念。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了完全打破经典的溶媒法提取工艺，而提出一种非化学溶剂提取申嗪霉素的方法，本发明采用二次絮凝法去除发酵液中的各种杂质再调酸得到高纯度的无溶剂残留的申嗪霉素原药。

研究发现，m18菌种在发酵过程中分泌pca的同时还主要分泌大量的粘多糖、蛋白质等胶状杂质，这些有机大分子杂质及菌体细胞在复合生物絮凝剂的作用下会发生桥联、电中和及基团反应形成颗粒状沉淀，过滤去沉以后可得纯清的发酵液，滤液中残留的少量有机大分子杂质及菌体细胞碎片又在复合生物絮凝剂的作用下产生吸附架桥，使细小的胶粒形成粗大的絮团。再次过滤可得高纯滤液；由于pca的分子中含有一个带负电荷的羧基基团，往高纯滤液中滴加有机酸溶液有大量结晶析出，可得到高纯的pca原药。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种非化学溶剂提取申嗪霉素的方法，包括以下步骤：

(1)发酵液先加复合生物絮凝剂sxn1进行一次絮凝，过滤洗涤后，得到一次滤清液，向一次滤清液中再加复合生物絮凝剂sxn2进行二次絮凝，再次过滤洗涤，得二次滤清液；

(2)二次滤清液精滤后，得高纯精滤液，向高纯精滤液中加有机酸溶液，进行析晶；

(3)对析晶后的结晶液离心分离，并干燥，得到申嗪霉素。

所述的发酵液由荧光假单胞菌m18经液体深层通风发酵而制成，荧光假单胞菌m18由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：cgmcc.no.0462。

步骤(1)中一次絮凝时，按发酵液体积的1.0％～2.5％加入复合生物絮凝剂sxn1水溶液，开启搅拌，使发酵液中形成大量的絮状悬浮物，然后悬浮液通过板框过滤进行固液分离，收集滤清液，滤饼用自来水顶洗，顶洗量为板框容积的1～3倍，并入滤清液中，得到一次滤清液。

所述的复合生物絮凝剂sxn1以水溶液的形式加入，复合生物絮凝剂sxn1水溶液浓度为1.5％～2.0％(w/v)；

所述的复合生物絮凝剂sxn1的成分为氯化钙和蛋白质，氯化钙质量分数为0.1％，余量为蛋白质，蛋白质分子中含有较多的疏水性氨基酸，包括丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸等，相对分子量为75万。

步骤(1)中二次絮凝时，按一次滤清液体积0.6％～2.0％加入复合生物絮凝剂sxn2水溶液，开启搅拌，使一次滤清液中残留的杂质形成絮状悬浮物，然后悬浮液通过板框过滤进行固液分离，收集滤清液，滤饼用自来水顶洗，顶洗量为板框容积的1～3倍，并入滤清液中，得到二次滤清液。

所述的复合生物絮凝剂sxn2以水溶液的形式加入，复合生物絮凝剂sxn2水溶液浓度为1.0％～1.5％(w/v)；

所述的复合生物絮凝剂sxn2成分为氯化钙和酸性蛋白聚糖，氯化钙质量分数为0.1％，余量为酸性蛋白聚糖，酸性蛋白聚糖以半乳糖醛酸为主要结构单元。

步骤(2)中，往高纯精滤液中滴加10％～15％(v/v)的有机酸水溶液，同时开启搅拌，待大量申嗪霉素晶体析出后，静置2～4小时，得到结晶液。

所述的有机酸为乳酸，以水溶液的形式加入，其水溶液浓度为10％～15％(v/v)。

步骤(3)中，采用离心机将结晶液离心分离，得申嗪霉素结晶湿体，再将申嗪霉素结晶湿体真空干燥，得到申嗪霉素原药，产品纯度在95％以上，成品率80％以上。

真空干燥条件是：温度控制在60～80℃，真空度控制在‐0.05～0.1mpa，时间为12～24小时，控制产品水分在2.0％以下。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明是基于非化学溶剂提纯发酵代谢产物的方法，即在不使用有机溶剂的条件下制备发酵高纯产品，其特点是采用了二次絮凝法去除荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)m18在发酵过程中产生的高分子粘多糖、蛋白质和菌体细胞等有机杂质，使发酵液高度纯化；再根据申嗪霉素分子结构中含有一个带负电荷的羧基基团的特点，采用有机酸析出结晶产品，得到高纯度、无溶剂残留的申嗪霉素原药。由于生产全过程不涉及到使用有机溶剂的情况，提取车间和提取设备都不需要特殊的防火和防爆设计，安全和环保方面得到保障，并且节省能源，生产成本和产品质量都优势明显，完全符合绿色农业生产资料的市场需求。

附图说明

图1为申嗪霉素标准品hplc图；

图2为实施例1申嗪霉素产品hplc图；

图3为实施例2申嗪霉素产品hplc图；

图4为实施例3申嗪霉素产品hplc图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

申嗪霉素发酵液15吨置预处理罐中，开启搅拌，转速30rpm，向发酵液中加入150l浓度为1.5％(w/v)的复合生物絮凝剂sxn1水溶液，继续搅拌30分钟，罐中料液逐渐形成大量的颗粒状悬浮物；将混悬料液进板框过滤，收集滤清液至滤液储罐中，滤饼用自来水顶洗，顶洗量为2吨，并入滤液储罐中。在上述滤清液中加入100l浓度为1.0％(w/v)的复合生物絮凝剂sxn2水溶液，搅拌20分钟，又有部分絮团形成，将该料液再进板框过滤，收集滤清液至滤液储罐中，滤饼用自来水顶洗，顶洗量为2吨，并入滤液储罐中。上述所得滤清液再经精细过滤器精滤，得高纯精滤液，放置精滤液储罐中；往高纯精滤液中缓慢滴加15％(v/v)的乳酸水溶液，同时开启搅拌，转速30～50rpm，待大量申嗪霉素晶体析出后，停止加入乳酸水溶液，静置2～4小时，晶液经离心机离心分离，离心转速为1400转/分，收集晶饼至不锈钢盘中，置真空干燥器中干燥，干燥温度控制在75℃，真空度控制在‐0.08mpa，干燥时间为24小时；得到的干晶置粉碎机中粉碎，过60目筛，取样检测主要技术指标，水分0.82％，产品纯度(含量)95.3％，成品收率81.4％。

所述的复合生物絮凝剂sxn1的成分为氯化钙和蛋白质，氯化钙质量分数为0.1％，余量为蛋白质，蛋白质分子中含有较多的疏水性氨基酸，包括丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸等，相对分子量为75万。

所述的复合生物絮凝剂sxn2成分为氯化钙和酸性蛋白聚糖，氯化钙质量分数为0.1％，余量为酸性蛋白聚糖，酸性蛋白聚糖以半乳糖醛酸为主要结构单元。

实施例2

申嗪霉素发酵液15吨置预处理罐中，开启搅拌，转速30rpm，向发酵液中加入200l浓度为1.5％(w/v)的复合生物絮凝剂sxn1水溶液，继续搅拌30分钟，罐中料液逐渐形成大量的颗粒状悬浮物；将混悬料液进板框过滤，收集滤清液至滤液储罐中，滤饼用自来水顶洗，顶洗量为2吨，并入滤液储罐中。在上述滤清液中加入150l浓度为1.0％(w/v)的复合生物絮凝剂sxn2水溶液，搅拌25分钟，又有部分絮团形成，将该料液再进板框过滤，收集滤清液至滤液储罐中，滤饼用自来水顶洗，顶洗量为2吨，并入滤液储罐中。上述所得滤清液再经精细过滤器精滤，得高纯精滤液，放置精滤液储罐中；往高纯精滤液中缓慢滴加15％(v/v)的乳酸水溶液，同时开启搅拌，转速30～50rpm，待大量申嗪霉素晶体析出后，停止加入乳酸水溶液，静置2～4小时，晶液经离心机离心分离，离心转速为1400转/分，收集晶饼至不锈钢盘中，置真空干燥器中干燥，干燥温度控制在75℃，真空度控制在‐0.08mpa，干燥时间为24小时；得到的干晶置粉碎机中粉碎，过60目筛，取样检测主要技术指标，水分0.89％，产品纯度(含量)95.5％，成品收率80.5％。

实施例3

申嗪霉素发酵液15吨置预处理罐中，开启搅拌，转速30rpm，向发酵液中加入250l浓度为1.5％(w/v)的复合生物絮凝剂sxn1水溶液，继续搅拌30分钟，罐中料液逐渐形成大量的颗粒状悬浮物；将混悬料液进板框过滤，收集滤清液至滤液储罐中，滤饼用自来水顶洗，顶洗量为2吨，并入滤液储罐中。在上述滤清液中加入200l浓度为1.0％(w/v)的复合生物絮凝剂sxn2水溶液，搅拌25分钟，又有部分絮团形成，将该料液再进板框过滤，收集滤清液至滤液储罐中，滤饼用自来水顶洗，顶洗量为2吨，并入滤液储罐中。上述所得滤清液再经精细过滤器精滤，得高纯精滤液，放置精滤液储罐中；往高纯精滤液中缓慢滴加15％(v/v)的乳酸水溶液，同时开启搅拌，转速30～50rpm，待大量申嗪霉素晶体析出后，停止加入乳酸水溶液，静置2～4小时，晶液经离心机离心分离，转速为1400转/分，收集晶饼至不锈钢盘中，置真空干燥器中干燥，干燥温度控制在75℃，真空度控制在‐0.08mpa，干燥时间为24小时；得到的干晶置粉碎机中粉碎，过60目筛，取样检测主要技术指标，水分0.85％，产品纯度(含量)95.6％，成品收率80.6％。各实施例的申嗪霉素产品hplc图分别如图2、3、4所示，申嗪霉素标准品hplc图如图1所示，各实施例的申嗪霉素原药主要技术指标如表1所示。

表1各实施例的申嗪霉素原药主要技术指标

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。