一种去除因原核包涵体表达变复性产生的多聚体的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体为一种去除因原核包涵体表达变复性产生的多聚体的方法。

背景技术：

原核表达是一种常用的异源表达方式，利用此表达系统能实现快速、大量、高效获得重组蛋白的目的，而且拥有成本低、耗时短、可控性强等优势，所以很多蛋白制剂企业都选用此表达系统，但此表达系统也有缺点，就是在表达过程中极易形成包涵体，虽然包涵体预示着较大的表达量，但经变复性后的活性回收率较低，这是因为产生的大部分目的蛋白在包涵体的变复性过程形成了大量多聚体，大大降低了回收目的蛋白的回收率，另外，这些多聚体还成为体系中的大分子杂质，需要添加后续工艺进行去除，增加工业化生产成本。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种去除因原核包涵体表达变复性产生的多聚体的方法，本发明在蛋白复性液中加入硫酸铵，使多聚体在盐析作用下发生聚沉，再通过离心的方法使其从体系中分离出来，从而得到含量较为单一的复性液。通过此优化工艺，可有效提高最终目的蛋白回收率，并显著降低下游工艺对设备及耗材等的消耗，另外，可节省部分精制工艺，从而在提高生产效率同时有效降低生产成本。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种去除因原核包涵体表达变复性产生的多聚体的方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化和发酵培养：将菌株进行活化培养，然后进行放大诱导发酵培养，收集发酵液中的菌体细胞，利用超声破碎法获得表达出的包涵体；

(2)包涵体变复性：向包涵体中加入变性液进行变性，离心收集变性完全的变性蛋白溶液，然后将收集到的变性蛋白溶液加入复性液中进行蛋白复性；

(3)硫酸铵沉淀：复性结束后，向复性液中添加硫酸铵固体，然后将复性液离心，收集上清液，得到去除多聚体后的复性蛋白溶液；

(4)蛋白精制：根据工艺要求，进行纯化工艺，最终获得目的蛋白制品。

作为优选，所述步骤(2)中先使用lysis buffer对包涵体进行清洗，然后向清洗后的包涵体中加入预冷到2℃～8℃的变性液进行变性。

作为优选，所述步骤(2)中将离心收集到的变性蛋白溶液逐滴加入预冷到 7℃～12℃的复性液中进行蛋白复性，复性液在7℃～12℃条件下低温复性14～18小时。

作为优选，所述步骤(2)中离心收集到的变性蛋白溶液与复性液的体积比为1:100。

作为优选，步骤(2)中所述复性液的组份包括：1.4mM GSH、1mM EDTA、0.5M精氨酸、0.5M尿素。

作为优选，所述复性液的pH值为8.5。

作为优选，所述步骤(3)中复性结束后，在250～300rpm的搅拌速度下，向复性液中缓慢添加烘干并研磨成粉的硫酸铵固体，待硫酸铵固体完全溶解后继续搅拌10～30分钟，在2℃～8℃条件下静置12～18小时。

作为优选，所述步骤(3)中将复性液在10000～12000rpm、2℃～8℃条件下离心30～45分钟。

作为优选，所述步骤(3)中添加硫酸铵固体至硫酸铵达到15％～45％饱和度。

作为优选，所述步骤(3)中添加硫酸铵固体至硫酸铵达到30％饱和度。

本发明的有益效果为：

(1)本发明通过优化工艺，彻底解决了原核包涵体表达中因变复性产生的多聚体引起回收率低下与增加杂质去除成本这两大难题，有效去除复性液体系中50％以上多聚体，既提高了复性液的比活，又减少了下游工艺中因大颗粒蛋白堵塞超滤膜、占用层析胶配体位点以及堵塞胶粒通道等对耗材的消耗，通过此工艺可节约耗材成本60％以上，从两个方面显著提升了科研单位及生产企业的产品制备效率与利润收益。

(2)经过硫酸铵沉淀，极大提高了粗制品在层析纯化中与凝胶的结合率，上样量由原来每毫升凝胶结合1毫克蛋白升至每毫升可结合20毫克。通过硫酸铵沉淀步骤，比原工艺耗材利用率提高20倍以上，这有效避免了重复上样，为实际操作节省了大量人力、物力、财力及时间成本，显著提升了生产效率。

(3)通过使用硫酸铵沉淀工艺，可有效提高最终目的蛋白回收率，降低生产成本，将蛋白纯化回收率提高近九倍，显著提升了综合生产效率，可带来总产值5倍以上的效益的增长。

(4)本发明使用一种优选配方的复性液，有效解决了原核包涵体表达中复性效率低下问题，提高了复性液中活性蛋白的回收率，显著提升了科研单位及生产企业的产品制备效率与利润收益。

附图说明

图1：不同饱和度硫酸铵沉淀乳腺癌靶向药物TP25复性液检测结果图；

图2：原始工艺所得TP25粗制品一倍上样后平衡液电泳结果图；

图3：经硫酸铵沉淀后所得TP25粗制品不同倍数上样后平衡液电泳结果图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的技术方案做进一步具体说明。

实施例1

一种去除原核包涵体表达因变复性产生的多聚体的方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化和发酵培养：将工程菌株(E.coli BL21)划线接种于选择性LB平板上，恒温37℃培养至出现单菌落，挑取单菌落与含卡那霉素液体LB培养基中进行培养；将培养好的种子以1:100的比例转接，进行放大发酵培养，2小时后对发酵液进行OD600检测，当OD值达到0.6～0.7时加入IPTG诱导表达7小时，收集发酵液中的工程菌菌体细胞，利用超声破碎法获得表达出的包涵体；

(2)包涵体变复性：使用lysis buffer(裂解缓冲液)对包涵体进行清洗，向处理好的包涵体中加入预冷到6℃的变性液进行变性，离心收集变性完全的变性蛋白溶液，将变性蛋白溶液逐滴加入预冷到10℃的复性液中进行蛋白复性，复性液在10℃条件下低温复性16小时，变性液与复性液的体积比为1:100，所述复性液的组份包括：1.4mM GSH、1mM EDTA、0.5M精氨酸、0.5M尿素，pH值为8.5；

(3)硫酸铵沉淀：复性结束后，在250rpm的搅拌速度下，向复性液中缓慢添加烘干并研磨成粉的硫酸铵固体至硫酸铵达到30％饱和度，待硫酸铵固体完全溶解后继续搅拌30分钟，在6℃条件下静置16小时，然后将复性液在11000rpm、6℃条件下离心35分钟，收集上清液，得到去除多聚体后的蛋白溶液；

(4)蛋白精制：根据工艺要求，进行层析等纯化工艺，最终获得纯度较高的目的蛋白制品。

实施例2

下面以HER2阳性乳腺癌单抗靶向蛋白药物TP25为例，进一步说明本发明的技术方案。

一种去除原核包涵体表达HER2阳性乳腺癌单抗靶向蛋白药物TP25因变复性产生的多聚体的方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化和发酵培养：将HER2阳性乳腺癌单抗靶向蛋白药物TP25工程 菌株(E.coli BL21)划线接种于选择性LB平板上，恒温37℃培养至出现单菌落，挑取单菌落与含卡那霉素液体LB培养基中进行培养；将培养好的种子以1:100的比例转接，进行放大发酵培养，2小时后对发酵液进行OD600检测，当OD值达到0.6～0.7时加入IPTG诱导表达5小时，收集发酵液中的工程菌菌体细胞，利用超声破碎法获得表达出的包涵体；

(2)包涵体变复性：使用lysis buffer(裂解缓冲液)对包涵体进行清洗，向处理好的包涵体中加入预冷到2℃的变性液进行变性，离心收集变性完全的变性蛋白溶液，将变性蛋白溶液逐滴加入预冷到7℃的复性液中进行蛋白复性，复性液在7℃条件下低温复性14小时，变性液与复性液的体积比为1:100，所述复性液的组份包括：1.4mM GSH、1mM EDTA、0.5M精氨酸、0.5M尿素，pH值为8.5；

(3)硫酸铵沉淀：复性结束后，在300rpm的搅拌速度下，向复性液中缓慢添加烘干并研磨成粉的硫酸铵固体至硫酸铵达到30％饱和度，待硫酸铵固体完全溶解后继续搅拌30分钟，在2℃条件下静置18小时，然后将复性液在10000、2℃条件下离心30分钟，收集上清液，得到去除多聚体后的蛋白药物TP25溶液；

(4)蛋白精制：将TP25粗制品进行阴离子交换树脂层析等纯化工艺，最终获得纯度较高的乳腺癌单抗药物TP25。

实施例3

下面以HER2阳性乳腺癌单抗靶向蛋白药物TP25为例，进一步说明本发明的技术方案。

一种去除原核包涵体表达HER2阳性乳腺癌单抗靶向蛋白药物TP25因变复性产生的多聚体的方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化和发酵培养：将HER2阳性乳腺癌单抗靶向蛋白药物TP25工程菌株(E.coli BL21)划线接种于选择性LB平板上，恒温37℃培养至出现单菌落，挑取单菌落与含卡那霉素液体LB培养基中进行培养；将培养好的种子以1:100的比例转接，进行放大发酵培养，2小时后对发酵液进行OD600检测，当OD值达到0.6～0.7时加入IPTG诱导表达9小时，收集发酵液中的工程菌菌体细胞，利用超声破碎法获得表达出的包涵体；

(2)包涵体变复性：使用lysis buffer(裂解缓冲液)对包涵体进行清洗，向处理好的包涵体中加入预冷到8℃的变性液进行变性，离心收集变性完全的变性蛋白溶液，将变性蛋白溶液逐滴加入预冷到12℃的复性液中进行蛋白复性，复性液在12℃条件下低温复性14小时，变性液与复性液的体积比为1:100，所述复性液的组份包括：1.4mM GSH、1mM EDTA、0.5M精氨酸、0.5M尿素，pH 值为8.5；

(3)硫酸铵沉淀：复性结束后，在300rpm的搅拌速度下，向复性液中缓慢添加烘干并研磨成粉的硫酸铵固体至硫酸铵达到30％饱和度，待硫酸铵固体完全溶解后继续搅拌10分钟，在8℃条件下静置12小时，然后将复性液在12000rpm、8℃条件下离心45分钟，收集上清液，得到去除多聚体后的TP25溶液；

(4)蛋白精制：将TP25粗制品进行阴离子交换树脂层析等纯化工艺，最终获得纯度较高的HER2阳性乳腺癌单抗靶向蛋白药物TP25。

实施例4：硫酸铵用量的确定

分别选用15％；20％；25％；30％；35％；45％饱和度硫酸铵沉淀TP25复性液，用于去除不完全复性的多聚体及杂蛋白。检测结果如图1所示。

由图1可以看出，30％硫酸铵饱和度时沉淀效果最好，单体几乎没有损失，且硫酸铵用量相对少，利于下游工艺硫酸根离子的去除。因此优选硫酸铵用量为30％硫酸铵饱和度。

实施例5：本发明与原始工艺各步骤所得蛋白量对比

在蛋白复性液中，多聚体由于其体积大、质量重，在硫酸铵的盐析作用下，极易发生聚沉，再通过离心的方法使其从体系中分离出来，便得到含量较为单一的复性液。通过此优化工艺，可有效提高最终目的蛋白回收率，并显著降低下游工艺对设备及耗材等的消耗，另外，可节省部分精制工艺，从而有效减少生产成本。收集原有工艺与本发明实施例2中各步骤所得蛋白量进行对比，数据如下表1所示：

表1.原有工艺与本发明各步骤所得蛋白量

注：表中数据为每升发酵液所得平均蛋白量。

从表1中数据可知，硫酸铵沉淀后，单位体积发酵液蛋白纯化回收率提高近九倍，最终制品收获量提高五倍，使约占总蛋白50％以上的多聚体以及未完全复性的杂蛋白经此步骤去除，有效降低了由大颗粒蛋白堵塞超滤膜、占用层析胶配体位点以及堵塞胶粒通道等问题，延长耗材的使用寿命，有效降低了生产成本。

实施例6：本发明与原始工艺所得粗制品在层析纯化中与凝胶的结合率

原始工艺的所得TP25粗制品，按每毫升凝胶结合1毫克蛋白上样后收集的平衡液电泳结果如图2所示，此时已有目的蛋白流出。

经硫酸铵沉淀后所得粗制品，每毫升凝胶分别上样3mg；4mg；6mg；7mg；13mg；18mg；20mg；22mg；24mg；25mg；45mg制品，收集平衡液，观察蛋白挂柱情况，结果如图3所示，图上方数字表示上样量。

从图3可以看出，上样量为每毫升凝胶结合22mg制品时目的蛋白有流出，因此将上样量定于每毫升凝胶结合20mg制品。经过硫酸铵沉淀，极大提高了粗制品在层析纯化中与凝胶的结合率，上样量由原来每毫升凝胶结合1毫克蛋白升至每毫升可结合20毫克。通过硫酸铵沉淀步骤，比原工艺耗材利用率提高20倍以上，这有效避免重复上样，为实际操作节省了大量人力、物力、财力及时间成本，同时提升了生产效率。

通过使用硫酸铵沉淀工艺，可提高产品产品收率，降低生产成本，显著提升了综合生产效率，可带来总产值5倍以上效益的增长。