本发明属于生物发酵技术领域，具体的说涉及一种桑黄菌丝体的液体发酵方法。
背景技术：
桑黄(Sanghuangporus sanghuang)，俗称桑黄、桑耳，最早收载于李时珍《本草纲目》中，是一种多年生药用真菌。桑黄的关键药效成分为桑黄多糖和桑黄黄酮，其中桑黄黄酮具有抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力等功效，是国际公认的最佳抗癌真菌之一。
现阶段，桑黄菌体及其关键药效成分的产量成为阻碍桑黄产品应用的瓶颈。由于液体深层发酵技术生产桑黄具有质量可控、生产周期短等特点，目前已成为获取桑黄及其活性物质的有效方法。近年来，桑黄的液体发酵技术取得了很大进展，但如何进一步提高桑黄菌丝体或关键药效成分的产量以提高其附加值，是桑黄开发利用函待解决的问题。
目前研究表明，香豆素、萘乙酸、肉桂酸、乙酸钠都能诱导桑黄黄酮的合成。这些工作为研究桑黄黄酮生物合成的调控机制提供了很好的材料和表型。但是上述诱导物对桑黄黄酮的增产效果均较低，如何大量增产桑黄黄酮仍需要探究更有效的诱导物。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种桑黄菌丝体的液体发酵方法，其是在桑黄菌丝体的液体发酵培养中添加0.7-1.1g/L的四水乙酸镁。
其中添四水乙酸镁，可以在发酵培养中的第0天、第1天、第2天或第3天中的任一天添加。
具体的说，本发明的桑黄菌丝体的液体发酵方法包括如下步骤：
(1)将桑黄菌种接种于种子培养基中，接种后于24-30℃、100-180r/min下培养5-9天，得到种子培养液；
(2)将种子培养液，按照5-15％(相对于发酵培养基)的接种量接入发酵培养基中，接种后于24-30℃、100-180r/min下培养6-10天，并在培养过程中添加0.7-1.1g/L的四水乙酸镁，培养获得桑黄菌丝体。
其中所述步骤(1)中的桑黄菌种为在斜面培养基中活化后的斜面菌丝体桑黄菌株，其中斜面培养基为：39g马铃薯葡萄糖琼脂溶于1L去离子水中灭菌后即得；
所述步骤(1)中的种子培养基的组分为：马铃薯葡萄糖肉汤24g/L，桑树粉10g/L，pH自然；
所述步骤(2)中的发酵培养基的组分为：葡萄糖20g/L，酵母自溶粉10g/L，七水硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾1g/L，桑树粉10g/L，pH自然；
所述步骤(2)中在培养过程中添加0.7-1.1g/L的四水乙酸镁，可以在发酵培养中的第0天、第1天、第2天或第3天中的任一天添加。
发酵结束的菌丝体，于5000r/min离心10min，弃上清液，用蒸馏水洗涤离心沉淀3-4次，收集沉淀于60℃干燥至恒重。测定菌丝体中的黄酮含量，发现远高于常规方法发酵得到的菌丝体中的黄酮含量。
本发明针对现有桑黄黄酮发酵产量不高的问题，提供了一种能显著提高桑黄菌丝体中黄酮含量的液体发酵方法，且生产工艺简单、添加物成本低廉、发酵时间相对较短，生成的桑黄菌丝体中黄酮的含量高，可应用于桑黄黄酮的工业化生产中。
具体实施方式
原料来源：
桑黄菌株为桑黄Sanghuangporus sanghuang(该菌株已在菌物学报，2016,35(5):1-12发表)，由上海市农业科学院食用菌研究所加工技术与发酵工程研究室保藏。
马铃薯葡萄糖琼脂和马铃薯葡萄糖肉汤均购自于美国BD公司；
实施例1
(1)种子培养基制备：马铃薯葡萄糖肉汤24g/L，桑树粉10g/L，pH自然。
(2)将斜面培养好的桑黄菌丝接种6-8块(每块面积约为0.03cm2-0.05cm2)于种子培养基中，于温度26℃，转速为150rpm下培养7天后，即得种子培养液。
(3)将培养好的种子培养液，按照10％的接种量接入发酵培养基(葡萄糖20g/L，酵母自溶粉10g/L，七水硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾1g/L，桑树粉10g/L，pH自然)中，接种后于26℃，150rpm下培养6天，在发酵第0天添加四水乙酸镁，四水乙酸镁的添加浓度0.9g/L，收集发酵后的菌丝体。
收集到的菌丝体于5000r/min离心10min，弃上清液，用蒸馏水洗涤离心沉淀3-4次，收集沉淀于60℃干燥至恒重。
测定桑黄黄酮含量：将干燥的桑黄菌丝体研磨成粉末后，69-69mg菌丝体加入2mL体积分数为80％的乙醇，于40℃超声(40KHz，100W)中提取2小时后，提取液于10000r/min离心8min，上清液即为待测样品溶液。加待测样品溶液1mL于试管中(设三个重复)，再加5％亚硝酸钠溶液1mL，充分混匀放置6min后，再加10％九水硝酸铝溶液1mL，摇匀放置6min；再加4％氢氧化钠溶液10mL，之后用体积分数为80％的乙醇定容，混匀后在510nm处测定样品的吸光度，样品的黄酮含量根据芦丁标准曲线上计算可得。采用该方法测得桑黄黄酮的含量为7.48mg/100mg，与对照(不加四水乙酸镁)的3.80mg/100mg相比，提高了96.84％。
实施例2
(1)种子培养基制备：马铃薯葡萄糖肉汤24g/L，桑树粉10g/L，pH自然。。
(2)将斜面培养好的桑黄菌丝接种6-8块(每块面积约为0.03cm2-0.05cm2)于种子培养基中，于温度26℃，转速为150rpm下培养7天后，即得种子培养液。
(3)将培养好的种子培养液，按照10％的接种量接入发酵培养基(葡萄糖20g/L，酵母自溶粉10g/L，七水硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾1g/L，桑树粉10g/L，pH自然)中，接种后于26℃，150rpm下培养6天，发酵第1天添加四水乙酸镁，四水乙酸镁的添加浓度0.9g/L，收集发酵菌丝体。
收集步骤(3)中发酵结束的菌丝体，于5000r/min离心10min，弃上清液，用蒸馏水洗涤离心沉淀3-4次，收集沉淀于60℃干燥至恒重。
测定桑黄黄酮含量：桑黄黄酮测定方法同实施例1。采用该方法测得桑黄黄酮的含量为8.86mg/100mg，与对照(不加四水乙酸镁)的3.80mg/100mg相比，提高了133.16％。实施例3
(1)种子培养基制备：马铃薯葡萄糖肉汤24g/L，桑树粉10g/L，pH自然。
(2)将斜面培养好的桑黄菌丝接种6-8块(每块面积约为0.03cm2-0.05cm2)于种子培养基中，于温度26℃，转速为150rpm下培养7天后，即得种子培养液。
(3)将培养好的种子培养液，按照10％的接种量接入发酵培养基(葡萄糖20g/L，酵母自溶粉10g/L，七水硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾1g/L，桑树粉10g/L，pH自然)中，接种后于26℃，150rpm下培养6天，发酵第2天添加四水乙酸镁，四水乙酸镁的添加浓度为0.9g/L，收集发酵后的菌丝体。
将发酵结束的菌丝体，于5000r/min离心10min，弃上清液，用蒸馏水洗涤离心沉淀3-4次，收集沉淀于60℃干燥至恒重。
测定桑黄黄酮含量：桑黄黄酮测定方法同实施例1。采用该方法测得桑黄黄酮的含量为7.74mg/100mg，与对照(不加四水乙酸镁)的3.80mg/100mg相比，提高了103.68％。实施例4
(1)种子培养基制备：马铃薯葡萄糖肉汤24g/L，桑树粉10g/L，pH自然。
(2)将斜面培养好的桑黄菌丝接种6-8块(每块面积约为0.03cm2-0.05cm2)于种子培养基中，于温度26℃，转速为150rpm下培养7天后，即得种子培养液。
(3)将培养好的种子培养液，按照10％的接种量接入发酵培养基(葡萄糖20g/L，酵母自溶粉10g/L，七水硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾1g/L，桑树粉10g/L，pH自然)中，接种后于26℃，150rpm下培养6天，发酵第3天添加四水乙酸镁，四水乙酸镁的添加浓度0.9g/L，收集发酵后的菌丝体。
发酵后的菌丝体，于5000r/min离心10min，弃上清液，用蒸馏水洗涤离心沉淀3-4次，收集沉淀于60℃干燥至恒重。
测定桑黄黄酮含量：桑黄黄酮测定方法同实施例1。采用该方法测得桑黄黄酮的含量为6.12mg/100mg，与对照(不加四水乙酸镁)的3.80mg/100mg相比，提高了61.05％。