本发明属于食用菌生产技术领域，尤其涉及一种全氧式菌包杂交组培活性液体接种技术。
背景技术：
液体菌种具有方便快捷、菌龄短、纯度高、活力强等优点，越来越受科研工作者和广大食用菌生产者的重视，具有有以下几种接种方法：一、料表面接种法：这是目前采用比较多的方法，采用这种接种方法时多为瓶装或袋装培养料，上端有一定的空间，如生产金针菇茶薪菇黑木耳杏鲍菇菌包以及生产香菇鸡腿菇平菇等各种菌种，接种时尽量将料表面喷淋上菌种，液种萌发生长快，封面早杂菌污染的机会很小，除破袋外菌袋污染的机会极低，甚至以万袋计算可以达到零污染。这种方法的菌球处于氧气充足的条件下生长很好。二、表面加枪头插入式接种法：因表面接种法接种时菌球易被培养料的过滤作用阻滞在料的上半部分，菌丝生长需要从上往下生长，不能在料内上下同时生长。如果将接种枪枪头做成管状插入料内接种，菌球在料内同时生长，可以缩短发菌时间一半左右，甚至更多。这种方法一要注意料内氧气的供应，不适应扎口袋，二要注意接种环境的无菌要求，避免菌种不萌发或枪头带入杂菌造成污染，成品率在98-100％，比固体菌种袋口接种缩短时间一半以上。三、袋表面扎孔接种法：长菌棒从两端接种不能缩短养菌时间，从袋的表面一面或两面，用枪头扎入3-5cm深并同时接种，扎孔间隔根据需要确定，如香菇每棒扎3-5个孔，这种方法调节接种量和孔间距离可以达到缩短养菌时间和减少杂菌污染的目的，缺点是用种量大，每个孔的接种量不少于10ml，接种后不封口的应达到每孔20ml以上。这种方法2007年大量生产香菇出菇菌棒，成品率高达99％以上。四、袋壁内喷射接种法：长菌棒还可以采取从两端一则用枪头分别扎入到袋薄膜内，从料与塑料薄膜之间喷射菌种，要求液体压力达到1kg/cm2以上，喷射后用手按压分散菌种，使菌棒一则布满菌种，待菌丝生长1-3cm后可以扎孔增氧。这种方法可以覆盖较大的料表面，发菌快袋面微孔污染小，缺点是用种量大，每喷射一次用种多在100ml左右。而且在配料时就要注意减少培养料的含水量。这种方法在香菇生产上应用比较成功。是我们在第三种方法的基础上改进的方法，期望今后适应开放接种的需要。五、接种后摇动接种法：颗粒菌种培养基接液体菌种最能发挥快速发菌的优势，液体菌种接入玻璃瓶后旋转或摇动使液体流动粘到每粒颗粒上，在适合温度下三天即可长满菌丝，继续培养几天让菌丝深入颗粒内部后即可用于生产。这种方法可以在急需用种时使用。六、接种机接种法：食用菌瓶栽工厂化企业使用的方法，接种速度一般7000-8000瓶/小时，菌液喷射在料面及孔洞中。
虽然上述接种方法已经盛行，且可以满足一般生产的需要，但是上述几种方法有的需要人工针刺通气供氧，有的需要人工扎孔排黄水，有的保温保湿性能差，有的出菇批次少，还不能满足大批量生产的需求。
技术实现要素：
本发明的目的在于提出一种不用人工针刺通气供氧，不用人工扎孔排黄水，保温保湿性能好，出菇批次多的全氧式菌包杂交组培活性液体接种技术。
为了实现上述目的，所采用的技术方案是：一种全氧式菌包杂交组培活性液体接种技术，先将食药用菌进行液体发酵，液体发酵技术是指在生化反应器中，模仿自然界将食药用菌在生育过程中所必需的糖类、有机和无机含有氮素的化合物、无机盐等一些微量元素以及其它营养物质溶解在水中作为培养基，灭菌后接入菌种，通入无菌空气并加以搅拌，提供食用菌菌体呼吸代谢所需要的氧气，并控制适宜的外界条件，进行菌丝大量培养繁殖的过程；液体菌种是用液体培养基培养而成的菌种，目前我国已能进行深层发酵的食用菌有：香菇、平菇、凤尾菇、美味侧耳、鲍鱼菇、金针菇、黑木耳、猴头、草菇、蜜环菌、茯苓、滑菇和冬虫夏草等，具体步骤有：
一、液体菌种的培养方法，有采用摇床来生产的摇瓶培养法和采用发酵罐来生产的深层培养法；若少量生产，可以用摇瓶培养法；深层培养需要一整套工业发酵设备，如锅炉、空气压缩机、空气净化系统、发酵罐等，故投资大，只适用于工厂化的大规模生产；而摇瓶培养投资少，设备技术简单，适合一般菌种厂生产使用；本节主要介绍摇瓶培养的技术方法；1、食用菌液体发酵的培养基根据培养基中组成的不同，可分为天然培养基和合成培养基；天然培养基的组成均为天然有机物；合成培养基则是采用一些已知化学成分的营养物质作培养基；在生产上，还根据工艺将培养基分为孢子培养基、种子培养基及发酵培养基；但无论如何划分，每一种培养基的组成中都离不开碳、氮、无机盐、微量元素、维生素和生长素等；①构成菌丝细胞的碳、氮比通常是：8-12∶1；由于菌丝生长过程中，一般需50％的碳源作为能量供给菌丝呼吸，另50％的碳源组成菌体细胞；因此培养基中理想碳、氮比的理论值为16-24∶1；太空包全氧通气，在液体培养中以菌丝增殖培养，通常碳、氮比以20∶1为宜；虽然食用真菌的液体培养一般要求较高的碳与氮比，即C∶N＝20∶1左右生长较好，但许多菌种也能在较宽的碳、氮比范围内生长；不同的菌种所要求合适的碳、氮比；②无机盐与微量元素，许多无机盐及微量元素对菌种的生理过程的影响与其浓度有关；不同的菌种，对无机盐及微量元素要求的最适浓度也不同；磷磷是细胞中核酸、核蛋白等重要物质的组成部分，又是许多辅酶高能磷酸键的组成部分；磷是食用菌液体发酵不可缺少的物质，常加入磷酸二氢钾以提供磷，加入量大约为0.1％-0.15％；镁在细胞中起着稳定核蛋白、细胞膜和核酸的作用，而且是一些重要酶的活化剂，是食用真菌液体培养中不可缺少的营养成分；一般通过加入硫酸镁以提供镁，浓度通常是0.05％-0.075％；钾、钙和钠，钾不参与细胞结构物质的构成，但控制原生质的胶态和细脑膜的透性；钙离子与细胞透性有关；钠离子能维持细胞渗透压，钠离子可以部分代替钾离子的作用；三种物质需求量甚微，若采用天然培养基，可不必另加；硫和铁，硫是菌体细胞蛋白质的组成部分，铁是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的组成部分，亦是菌体有氧代谢中不可缺少的元素；锌、锰、钴、铜锌、锰、钴等离子是某些酶的辅基或激活剂；铜是多元酚氧化酶的活性基；在配制培养基时应注意，镁和磷的添加不宜过多，否则会带来危害；菌体对锌、锰、钴、铜等微量元素的需求量甚少，一般天然有机原料中均有，不必另加；碳酸钙本身不溶于水，但可以调节培养其中的酸碱度；磷酸盐与碳酸钙不宜混合灭菌，否则会形成不溶于水的磷酸盐，使可溶性的磷酸盐浓度大大降低；③维生素，维生素在细胞中作为辅酶的成分，具有催化功能；大多数食用真菌的培养都与B族维生素有关，维生素B1是目前已知对绝大多数食用真菌生长有利的维生素；其适宜浓度在50-1000μg/L之间；2、摇瓶振荡培养技术，培养液配制好后，装入500mL容量的三角烧瓶中，每瓶装量为100mL，并加入0～15粒小玻璃珠，加棉塞后再包扎牛皮纸封口，在1.5kg/cm2压力下灭菌30分钟，取出冷却到30℃以下时，接入一块约2平方厘米的斜面菌种，于23℃～25℃下静置培养48小时，再置往复式摇床上振荡培养，振荡频率为80～100次/分，振幅6cm～10cm；如果用旋转式摇床，振荡频率为200～220转/分；摇床室温控制在24℃～25℃，培养时间因菌类不同而异，一般是在7天左右；培养结束的标准是：培养液清澈透明，液中悬浮着大量小菌丝球，并伴有各种菇类特有的香味；
二、液体菌种的检验方法，对液体菌种进行检验可采用感官检查和取样测验相结合的方法；1、感官检查可采用“看、旋、嗅”的步骤进行检查；看：将样品静置桌上观察；一看菌液颜色和透明度，正常发酵醪液呈黄色或黄褐色，清澈透明，菌丝颜色因菌种而异，老化后颜色变深；染杂菌的醪液则混浊不透明；二看菌丝形态和大小，正常的菌丝大小一致，呈球状、片状、絮状或棒状，菌丝粗壮，线条分明；而染杂菌后，菌丝纤细，轮廓不清；三看上清液与沉淀的比例，菌丝体占比例越大越好，较好的液体菌种，在瓶中所占比例可达80％左右；四看pH值指标是否变色，在培养液中加入甲基红或复合指标剂，经3～5天颜色改变，说明培养液pH值到达4.0左右，为发酵点；如果在24小时内即变色，说明因杂菌快速生长而使培养液酸度剧变；五看有无酵母线，如果在培养液与空气交界处的瓶壁上有灰色条状附着物，说明为酵母菌污染所致，此称为酵母线；旋：手提样品瓶轻轻旋转一下，观其菌丝体的特点；醪液的粘稠度高，说明菌种性能好；稀薄者表明菌球少，不宜使用；菌丝的悬浮力好，放置5分钟不沉淀，表明菌种生长力强；反之，如果菌丝极易沉淀，说明菌丝已老化或死亡；再次观其菌丝状态，大小不一，毛刺明显，表明是供氧不足；如果菌球缩小且光滑，或菌丝纤细并有自溶现象，说明污染了杂菌；嗅：在旋转样品后，打开瓶盖嗅气味；培养好的优质液体菌种，均具有芳香气味；而染杂菌的培养液则散发出酸、甜、霉、臭等各种异味；2、取样测验可取液体菌种进行称重检查和粘度检查；生长力测定和出菇试验；化学检查，包括测pH值、糖含量和氧含量等；显微检查，包括细胞分裂状态观察、普通染色和特殊染色等；
三、液体菌种的使用方法，液体菌种可作原种使用，也可作栽培使用；1、作原种取一支100ml，兽用注射器，去掉针尖，换一根内径1mm～2mm，长100mm～120mm的不锈钢钢管，制成一个菌种接种器；使用前，洗净接种器并用纱布包好，经高压蒸汽灭菌，冷却后抽取液体菌种即可进行接种；经灭菌待接入菌种的原种瓶，先要在无菌条件下去掉棉塞，并改换无菌薄膜包扎瓶口；接种时，将针管插入瓶口上的薄膜，每瓶接种量为10mL～15ml，要注意使液体菌种均匀分布在培养基表面，拔出针管后要立即用胶布贴封针孔，竖放在培养室的床架上进行培养；2、作栽培种或直接进行栽培液体菌种在作栽培使用时，瓶栽的每瓶接种量为10mL～15mL；熟料袋栽的每袋接种量为，小袋10mL～15mL，大袋的20mL～30mL；开放式床栽的，每平方米接种量为500mL～1000mL，不需要接种针筒，可直接均匀洒在培养料面，或进行穴播。
本发明的优点是：不用人工针刺通气供氧，不用人工扎孔排黄水，保温保湿性能好，出菇批次多，一次装料接种根据菇类不同可连续采收鲜菇3-6个月；一年两次生产接种，全年受益。利用太空包全氧通气培菌，菌丝生长快速旺盛，提高培菌速度50％以上。实现液体菌种产业化，解决了集约化生产食用菌的瓶颈。一次性便携式接种瓶的发明应用，使液体菌种分散接种成为现实，普通栽培户也能用于生产，提高接种效率。液体菌种具有纯度高，流动性强，发菌快，成品率高，出菇一致的优点。
具体实施方式
下面具体实施方式对本发明作进一步说明：
实施例，一种全氧式菌包杂交组培活性液体接种技术，先将食药用菌进行液体发酵，液体发酵技术是指在生化反应器中，模仿自然界将食药用菌在生育过程中所必需的糖类、有机和无机含有氮素的化合物、无机盐等一些微量元素以及其它营养物质溶解在水中作为培养基，灭菌后接入菌种，通入无菌空气并加以搅拌，提供食用菌菌体呼吸代谢所需要的氧气，并控制适宜的外界条件，进行菌丝大量培养繁殖的过程；液体菌种是用液体培养基培养而成的菌种，目前我国已能进行深层发酵的食用菌有：香菇、平菇、凤尾菇、美味侧耳、鲍鱼菇、金针菇、黑木耳、猴头、草菇、蜜环菌、茯苓、滑菇和冬虫夏草等，具体步骤有：
一、液体菌种的培养方法，有采用摇床来生产的摇瓶培养法和采用发酵罐来生产的深层培养法；若少量生产，可以用摇瓶培养法；深层培养需要一整套工业发酵设备，如锅炉、空气压缩机、空气净化系统、发酵罐等，故投资大，只适用于工厂化的大规模生产；而摇瓶培养投资少，设备技术简单，适合一般菌种厂生产使用；本节主要介绍摇瓶培养的技术方法；1、食用菌液体发酵的培养基根据培养基中组成的不同，可分为天然培养基和合成培养基；天然培养基的组成均为天然有机物；合成培养基则是采用一些已知化学成分的营养物质作培养基；在生产上，还根据工艺将培养基分为孢子培养基、种子培养基及发酵培养基；但无论如何划分，每一种培养基的组成中都离不开碳、氮、无机盐、微量元素、维生素和生长素等；①构成菌丝细胞的碳、氮比通常是：8-12∶1；由于菌丝生长过程中，一般需50％的碳源作为能量供给菌丝呼吸，另50％的碳源组成菌体细胞；因此培养基中理想碳、氮比的理论值为16-24∶1；太空包全氧通气，在液体培养中以菌丝增殖培养，通常碳、氮比以20∶1为宜；虽然食用真菌的液体培养一般要求较高的碳与氮比，即C∶N＝20∶1左右生长较好，但许多菌种也能在较宽的碳、氮比范围内生长；不同的菌种所要求合适的碳、氮比；②无机盐与微量元素，许多无机盐及微量元素对菌种的生理过程的影响与其浓度有关；不同的菌种，对无机盐及微量元素要求的最适浓度也不同；磷磷是细胞中核酸、核蛋白等重要物质的组成部分，又是许多辅酶高能磷酸键的组成部分；磷是食用菌液体发酵不可缺少的物质，常加入磷酸二氢钾以提供磷，加入量大约为0.1％-0.15％；镁在细胞中起着稳定核蛋白、细胞膜和核酸的作用，而且是一些重要酶的活化剂，是食用真菌液体培养中不可缺少的营养成分；一般通过加入硫酸镁以提供镁，浓度通常是0.05％-0.075％；钾、钙和钠，钾不参与细胞结构物质的构成，但控制原生质的胶态和细脑膜的透性；钙离子与细胞透性有关；钠离子能维持细胞渗透压，钠离子可以部分代替钾离子的作用；三种物质需求量甚微，若采用天然培养基，可不必另加；硫和铁，硫是菌体细胞蛋白质的组成部分，铁是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的组成部分，亦是菌体有氧代谢中不可缺少的元素；锌、锰、钴、铜锌、锰、钴等离子是某些酶的辅基或激活剂；铜是多元酚氧化酶的活性基；在配制培养基时应注意，镁和磷的添加不宜过多，否则会带来危害；菌体对锌、锰、钴、铜等微量元素的需求量甚少，一般天然有机原料中均有，不必另加；碳酸钙本身不溶于水，但可以调节培养其中的酸碱度；磷酸盐与碳酸钙不宜混合灭菌，否则会形成不溶于水的磷酸盐，使可溶性的磷酸盐浓度大大降低；③维生素，维生素在细胞中作为辅酶的成分，具有催化功能；大多数食用真菌的培养都与B族维生素有关，维生素B1是目前已知对绝大多数食用真菌生长有利的维生素；其适宜浓度在50-1000μg/L之间；2、摇瓶振荡培养技术，培养液配制好后，装入500mL容量的三角烧瓶中，每瓶装量为100mL，并加入0～15粒小玻璃珠，加棉塞后再包扎牛皮纸封口，在1.5kg/cm2压力下灭菌30分钟，取出冷却到30℃以下时，接入一块约2平方厘米的斜面菌种，于23℃～25℃下静置培养48小时，再置往复式摇床上振荡培养，振荡频率为80～100次/分，振幅6cm～10cm；如果用旋转式摇床，振荡频率为200～220转/分；摇床室温控制在24℃～25℃，培养时间因菌类不同而异，一般是在7天左右；培养结束的标准是：培养液清澈透明，液中悬浮着大量小菌丝球，并伴有各种菇类特有的香味；
二、液体菌种的检验方法，对液体菌种进行检验可采用感官检查和取样测验相结合的方法；1、感官检查可采用“看、旋、嗅”的步骤进行检查；看：将样品静置桌上观察；一看菌液颜色和透明度，正常发酵醪液呈黄色或黄褐色，清澈透明，菌丝颜色因菌种而异，老化后颜色变深；染杂菌的醪液则混浊不透明；二看菌丝形态和大小，正常的菌丝大小一致，呈球状、片状、絮状或棒状，菌丝粗壮，线条分明；而染杂菌后，菌丝纤细，轮廓不清；三看上清液与沉淀的比例，菌丝体占比例越大越好，较好的液体菌种，在瓶中所占比例可达80％左右；四看pH值指标是否变色，在培养液中加入甲基红或复合指标剂，经3～5天颜色改变，说明培养液pH值到达4.0左右，为发酵点；如果在24小时内即变色，说明因杂菌快速生长而使培养液酸度剧变；五看有无酵母线，如果在培养液与空气交界处的瓶壁上有灰色条状附着物，说明为酵母菌污染所致，此称为酵母线；旋：手提样品瓶轻轻旋转一下，观其菌丝体的特点；醪液的粘稠度高，说明菌种性能好；稀薄者表明菌球少，不宜使用；菌丝的悬浮力好，放置5分钟不沉淀，表明菌种生长力强；反之，如果菌丝极易沉淀，说明菌丝已老化或死亡；再次观其菌丝状态，大小不一，毛刺明显，表明是供氧不足；如果菌球缩小且光滑，或菌丝纤细并有自溶现象，说明污染了杂菌；嗅：在旋转样品后，打开瓶盖嗅气味；培养好的优质液体菌种，均具有芳香气味；而染杂菌的培养液则散发出酸、甜、霉、臭等各种异味；2、取样测验可取液体菌种进行称重检查和粘度检查；生长力测定和出菇试验；化学检查，包括测pH值、糖含量和氧含量等；显微检查，包括细胞分裂状态观察、普通染色和特殊染色等；
三、液体菌种的使用方法，液体菌种可作原种使用，也可作栽培使用；1、作原种取一支100ml，兽用注射器，去掉针尖，换一根内径1mm～2mm，长100mm～120mm的不锈钢钢管，制成一个菌种接种器；使用前，洗净接种器并用纱布包好，经高压蒸汽灭菌，冷却后抽取液体菌种即可进行接种；经灭菌待接入菌种的原种瓶，先要在无菌条件下去掉棉塞，并改换无菌薄膜包扎瓶口；接种时，将针管插入瓶口上的薄膜，每瓶接种量为10mL～15ml，要注意使液体菌种均匀分布在培养基表面，拔出针管后要立即用胶布贴封针孔，竖放在培养室的床架上进行培养；2、作栽培种或直接进行栽培液体菌种在作栽培使用时，瓶栽的每瓶接种量为10mL～15mL；熟料袋栽的每袋接种量为，小袋10mL～15mL，大袋的20mL～30mL；开放式床栽的，每平方米接种量为500mL～1000mL，不需要接种针筒，可直接均匀洒在培养料面，或进行穴播。
最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定；对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。