本发明属于食用菌培植
技术领域：
，特别涉及制备金针菇液体菌种的新方法。
背景技术：
：金针菇既是一种美味食品，又是较好的保健食品，其富含B族维生素、维生素C、碳水化合物、矿物质、胡萝卜素、多种氨基酸、植物血凝素、多糖、牛磺酸、香菇嘌呤、麦冬甾醇、细胞溶解毒素、冬菇细胞毒素等，对增强智力尤其是对儿童的身高和智力发育有良好的作用，国外称之为“增智菇”。金针菇具有很高的药用价值，经常使用金针菇能够增强机体对癌细胞的抗御能力，常食金针菇还能降胆固醇，预防肝脏疾病和肠胃道溃疡，增强机体正气，防病健身。总之，金针菇营养价值高、口味好，颇受广大消费者的青睐，市场需求量不断增加，从而推动金针菇的产业发展向规模化、工业化前进。液体培养具有很多如周期短、产量高、占地面积少、便于操控、生产条件稳定等优点，有关金针菇菌种液体培养技术的研究虽有一些报道，但多以利用发酵液或菌丝体为目的，对培养过程中影响菌丝活性的生理指标研究甚少，目前尚缺乏有效控制发酵过程的技术参数。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供制备金针菇液体菌种的新方法，技术方案为：本发明提供制备金针菇液体菌种的新方法，包括如下步骤：(1)、金针菇一级种的制备，取金针菇菌株接种于斜面培养基上，在23-25℃条件下，培养10-13天；(2)、摇瓶菌种的培养，取斜面母种，按照液体培养基体积百分比10-18％的接种量，接种到装有80-120mL摇瓶液体培养基的500mL培养瓶中，培养5-8天得摇瓶菌种；培养条件为：温度25-28℃，震荡速率为120-190转/min，湿度65-80％，二氧化碳浓度为1500-2800ppm；(3)、摇瓶菌种的摇瓶菌种的发酵罐培养，将摇瓶菌种按发酵培养基体积百分比7-15％的接种量接种至装有5.5L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，培养时间为4天，培养条件为：第1天，培养温度20-25℃，通气量：每分钟每1L发酵液通入的空气量为0.5-0.7L，搅拌速度为150-170r/min，压力为0.1-0.15MPa，初始PH为3.5-4.8；第2-3天，培养温度为15-18℃，通气量：每分钟每1L发酵液通入的空气量为1.5-2L，搅拌速度210-240r/min，压力为0.4-0.6MPa；第4天，培养温度20-22℃，通气量：每分钟每1L发酵液通入的空气量为0.8-1L，搅拌速度210-240r/min，压力为0.1-0.2MPa，调节PH值为5.1-6.3。斜面培养基可为PDA培养基，即马铃薯葡萄糖培养基，配方：葡萄糖20g，琼脂18g，马铃薯煮的汁的过滤液1000ml；摇瓶菌种的培养、二级摇瓶培养和发酵培养基均可为常用金针菇液体培养基，例如PDB液体培养基，配方：葡萄糖20g，马铃薯煮的汁的过滤液1000ml。本发明所提供的金针菇液体菌种的制备方法，经过大量试验得到培养过程中的合理技术参数，利用本发明所述的制备方法得到的金针菇液体菌种，品质好，产量高，大大缩短了培养时间，有效提供培养效率，为金针菇液体菌种培养工厂化提供有效的技术参数。进一步地，所述摇瓶菌种的培养过程中采用暗培养和光培养两个阶段进行，所述暗培养阶段为初始2-3天，所述光培养阶段为剩余时间，优选地，光培养所需的光照强度为560-800勒克斯。优选培养基为，摇瓶液体培养基包括如下重量百分比的组分：2-3％豆粕、1-2％红糖、0.3-0.8％酵母膏、0.02-0.05％七水硫酸镁、0.01-0.02％碘化钾、0.01-0.03％碳酸铯、0.03-0.05％土霉素、0.01-0.02％氰钴胺、0.08-0.1％胆碱、0.05-0.07％维甲酸、0.12-0.21％缬氨酸、0.1-0.2％糖胺聚糖，余量为水。进一步优选，发酵培养基包括如下重量百分比的组分：1.5-2.5％大米粉、2-3％玉米粉、3-5％红糖、0.5-1.2％酵母膏、0.03-0.05％七水硫酸镁、0.01-0.02％碘化钾、0.02-0.05％土霉素、0.08-0.1％氰钴胺、0.06-0.09％胆碱、0.15-0.3％缬氨酸、0.02-0.07％左旋肉碱、0.12-0.21％透明质酸、0.01-0.03％木质素磺酸钠、0.05-0.1％乙醇胺，余量为水。本发明另一方面，提供了适用于金针菇液体菌种培养的培养基，在优化基本的碳源、氮源、维生素和无机盐的基础上，进一步改良添加营养成分，诱导菌丝的有效增长；使用本发明所提供的培养基进行培养的金针菇液体菌种，颜色洁白，活性优良，菌丝球性状较佳，且产量高。进一步地，发酵培养基的制备方法为：将大米粉和玉米粉加入到二分之一水中稀释，并打浆，得到混合浆液，灭菌后待用；将红糖、酵母膏、土霉素和透明质酸加入到四分之一水中，搅拌并加热到45-60℃后，向水溶液中依次加入碘化钾、左旋肉碱、木质素磺酸钠、缬氨酸、乙醇胺、氰钴胺、胆碱、七水硫酸镁混合均匀，55℃搅拌30min，得到营养液，灭菌后待用；将灭菌后的混合浆液和营养液混合均匀，加剩余四分之一水定容后，混合均匀即得发酵培养基。其中，混合浆液灭菌条件为：灭菌锅内温度137-142℃，压力为85KPa，灭菌时间为80-90min；营养液灭菌条件为：灭菌锅内温度150-160℃，压力为90KPa，灭菌时间为25-40min。进一步地，发酵培养基中还包括重量百分比为1.5-2％的桑葚、土豆和丝瓜藤混合物的水浸提取物，桑葚、土豆和丝瓜藤的质量比为1:1:3，制备方法为：将桑葚和土豆剪切成1-2cm3的小块，将丝瓜藤剪切成1-2cm的长条，混合后加入原料总重量5-8倍的水打成浆液，将浆液加热到75-85℃后，热过滤，得到的滤液减压浓缩即得水浸提物。添加上述水浸提物，可进一步促进菌丝对培养基中营养成分的吸收、分解和利用，产生的菌丝体产量更高，均一性更佳，质量更好，处理较为容易。本发明所提供的金针菇液体菌种的制备方法，经过大量试验得到培养过程中的合理技术参数，并对发酵过程进行详细分级培养，提供了金针菇菌种生长和发育的良好环境和条件，得到的金针菇液体菌种，品质好，产量高，可实现对金针菇液体菌种的大量制备。使用本发明所提供的液态培养基培养的金针菇液态菌种，菌丝白色浓密，可达到738个/ml，产量高，且大小均一，菌球直径均在有效菌种2.0mm内；菌株的活性强，菌丝球边缘多毛刺，菌丝间具有横隔，有锁状联合，菌球由菌丝紧密缠绕而成，且无杂菌污染；菌株对培养液中的大分子营养物质的分解利用完全，生长状好。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的描述。实施例1提供制备金针菇液体菌种的新方法，如下步骤：(1)、配置斜面培养基，取金针菇菌株接种于斜面培养基上，在23℃条件下，培养13天；(2)、摇瓶菌种的培养，取斜面母种，按照液体培养基体积百分比10％的接种量，接种到装有80mL摇瓶液体培养基的500mL培养瓶中，培养5天得摇瓶菌种；培养条件为：温度25℃，震荡速率为120r/min，湿度80％，二氧化碳浓度为2800ppm；(4)、摇瓶菌种的发酵罐培养，将摇瓶菌种按发酵培养基体积百分比7％的接种量接种至装有5.5L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，培养时间为4天，培养条件为：第1天，培养温度20℃，通气量：每分钟每1L发酵液通入的空气量为0.5L，搅拌速度为150r/min，压力为0.1MPa，初始PH为4.8；第2-3天，培养温度为18℃，通气量：每分钟每1L发酵液通入的空气量为2L，搅拌速度210r/min，压力为0.4MPa；第4天，培养温度22℃，通气量：每分钟每1L发酵液通入的空气量为1L，搅拌速度210r/min，压力为0.1MPa，调节PH值为5.1。实施例2提供制备金针菇液体菌种的新方法，如下步骤：(1)、配置斜面培养基，取金针菇菌株接种于斜面培养基上，在25℃条件下，培养10天；(2)、摇瓶菌种的培养，取斜面母种，按照液体培养基体积百分比18％的接种量，接种到装有120mL摇瓶液体培养基的500mL培养瓶中，培养8天得摇瓶菌种；培养条件为：温度28℃，震荡速率为190r/min，湿度65％，二氧化碳浓度为1500ppm；其中第1-3天暗培养，第4-8天光培养，光照强度为560勒克斯；(4)、摇瓶菌种的发酵罐培养，将摇瓶菌种按发酵培养基体积百分比15％的接种量接种至装有5.5L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，培养时间为4天，培养条件为：第1天，培养温度25℃，通气量：每分钟每1L发酵液通入的空气量为0.7L，搅拌速度为150-170r/min，压力为0.15MPa，初始PH为3.5；第2-3天，培养温度为15℃，通气量：每分钟每1L发酵液通入的空气量为1.5L，搅拌速度240r/min，压力为0.6MPa；第4天，培养温度20℃，通气量：每分钟每1L发酵液通入的空气量为0.8L，搅拌速度240r/min，压力为0.2MPa，调节PH值为6.3。实施例3提供制备金针菇液体菌种的新方法，与实施例1区别在于，进一步限定，摇瓶液体培养基包括如下重量百分比的组分：2％豆粕、1％红糖、0.3％酵母膏、0.02％七水硫酸镁、0.01％碘化钾、0.01％碳酸铯、0.03％土霉素、0.01％氰钴胺、0.08％胆碱、0.05％维甲酸、0.12％缬氨酸、0.1％糖胺聚糖，余量为水。实施例4提供制备金针菇液体菌种的新方法，与实施例1区别在于，进一步限定，摇瓶液体培养基包括如下重量百分比的组分：3％豆粕、2％红糖、0.8％酵母膏、0.05％七水硫酸镁、0.02％碘化钾、0.03％碳酸铯、0.05％土霉素、0.02％氰钴胺、0.1％胆碱、0.07％维甲酸、0.21％缬氨酸、0.2％糖胺聚糖，余量为水。实施例5提供制备金针菇液体菌种的新方法，与实施例4区别在于，进一步限定，发酵培养基包括如下重量百分比的组分：2％大米粉、2.3％玉米粉、4％红糖、1.0％酵母膏、0.04％七水硫酸镁、0.01％碘化钾、0.03％土霉素、0.09％氰钴胺、0.07％胆碱、0.2％缬氨酸、0.04％左旋肉碱、0.18％透明质酸、0.02％木质素磺酸钠、0.07％乙醇胺，余量为水。实施例6提供制备金针菇液体菌种的新方法，与实施例5区别在于，进一步限定，发酵培养基包括如下重量百分比的组分：1.5％大米粉、2％玉米粉、3％红糖、0.5％酵母膏、0.03％七水硫酸镁、0.01％碘化钾、0.02％土霉素、0.08％氰钴胺、0.06％胆碱、0.15％缬氨酸、0.02％左旋肉碱、0.12％透明质酸、0.01％木质素磺酸钠、0.05％乙醇胺，1.5％的质量比为1:1:3桑葚、土豆和丝瓜藤混合物的水浸提取物，余量为水。实施例7提供制备金针菇液体菌种的新方法，与实施例5区别在于，进一步限定，发酵培养基包括如下重量百分比的组分：2.5％大米粉、3％玉米粉、5％红糖、1.2％酵母膏、0.05％七水硫酸镁、0.02％碘化钾、0.05％土霉素、0.1％氰钴胺、0.09％胆碱、0.3％缬氨酸、0.07％左旋肉碱、0.21％透明质酸、0.03％木质素磺酸钠、0.1％乙醇胺，2％的质量比为1:1:3桑葚、土豆和丝瓜藤混合物的水浸提取物，余量为水。其中，桑葚、土豆和丝瓜藤混合物的水浸提取物制备方法如下：将桑葚和土豆剪切成1-2cm3的小块，将丝瓜藤剪切成1-2cm的长条，混合后加入原料总重量5-8倍的水打成浆液，将浆液加热到75-85℃后，热过滤，得到的滤液减压浓缩，灭菌后即得水浸提物。发酵培养基的制备方法如下：将大米粉和玉米粉加入到二分之一水中稀释，并打浆，得到混合浆液，灭菌后待用；将红糖、酵母膏、土霉素和透明质酸加入到四分之一水中，搅拌并加热到45-60℃后，向水溶液中依次加入碘化钾、左旋肉碱、木质素磺酸钠、缬氨酸、乙醇胺、氰钴胺、胆碱、七水硫酸镁混合均匀，55℃搅拌30min，得到营养液，灭菌后待用；将灭菌后的混合浆液、营养液和水浸提取混合均匀，加剩余四分之一水定容后，混合均匀即得发酵培养基。对照实施例1提供制备金针菇液体菌种的新方法，与实施例1区别在于，步骤(4)摇瓶菌种的发酵罐培养条件为：将摇瓶菌种按发酵培养基体积百分比7％的接种量接种至装有5.5L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，培养时间为4天，培养条件为：培养温度20℃，通气量：每分钟每1L发酵液通入的空气量为0.5L，搅拌速度为150r/min，压力为0.1MPa，初始PH为4.8。对照实施例2提供制备金针菇液体菌种的新方法，与实施例1区别在于，(步骤(4)摇瓶菌种的发酵罐培养条件为：将摇瓶菌种按发酵培养基体积百分比7％的接种量接种至装有5.5L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，培养时间为4天，培养条件为：培养温度为18℃，通气量：每分钟每1L发酵液通入的空气量为2L，搅拌速度210r/min，压力为0.4MPa。对照实施例3提供制备金针菇液体菌种的新方法，与实施例1区别在于，步骤(4)摇瓶菌种的发酵罐培养条件为：将摇瓶菌种按发酵培养基体积百分比7％的接种量接种至装有5.5L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，培养时间为4天，培养条件为：培养温度22℃，通气量：每分钟每1L发酵液通入的空气量为1L，搅拌速度210r/min，压力为0.1MPa，调节PH值为5.1。对照实施例4提供制备金针菇液体菌种的新方法，与实施例5区别在于，摇瓶液体培养基包括如下重量百分比的组分：3％玉米粉、2％红糖、0.8％酵母膏、0.05％七水硫酸镁、0.02％碘化钾、0.02％氰钴胺、0.05％缬氨酸、0.4％糖胺聚糖，余量为水；发酵培养基包括如下重量百分比的组分：2％大米粉、2.3％玉米粉、4％红糖、1.0％酵母膏、0.04％七水硫酸镁、0.01％碘化钾、0.03％土霉素、0.09％氰钴胺、0.07％胆碱、0.2％缬氨酸、0.04％左旋肉碱、0.18％透明质酸、0.02％木质素磺酸钠、0.07％乙醇胺，余量为水。对照实施例5提供制备金针菇液体菌种的新方法，与实施例5区别在于，摇瓶液体培养基包括如下重量百分比的组分：3％玉米粉、2％红糖、0.8％酵母膏、0.05％七水硫酸镁、0.02％碘化钾、0.03％碳酸铯、0.05％土霉素、0.02％氰钴胺、0.1％胆碱、0.05％缬氨酸、0.4％糖胺聚糖，余量为水；发酵培养基包括如下重量百分比的组分：2％大米粉、2.3％玉米粉、4％红糖、1.0％酵母膏、0.04％七水硫酸镁、0.01％碘化钾、0.09％氰钴胺、0.07％胆碱、0.07％乙醇胺，余量为水。对照实施例6提供制备金针菇液体菌种的新方法，与实施例5区别在于，摇瓶液体培养基包括如下重量百分比的组分：3％玉米粉、2％红糖、0.8％酵母膏、0.05％七水硫酸镁、0.02％碘化钾、0.02％氰钴胺、0.05％缬氨酸、0.4％糖胺聚糖，余量为水；发酵培养基包括如下重量百分比的组分：2％大米粉、2.3％玉米粉、4％红糖、1.0％酵母膏、0.04％七水硫酸镁、0.01％碘化钾、0.09％氰钴胺、0.07％胆碱、0.07％乙醇胺，余量为水。试验例1不同制备方法对金针菇液体菌种的影响一、试验材料1.1菌种金针菇908，陕西众兴高科生物科技有限公司提供。1.2培养基斜面培养基为PDA培养基：葡萄糖20g，琼脂18g，马铃薯煮的汁的过滤液1000ml；摇瓶液体培养基及发酵培养基均为：葡萄糖20g，酵母膏3g，磷酸二氢钾0.15g、七水硫酸镁0.05g，马铃薯煮的汁的过滤液1000ml。二、培养方法取上述金针菇菌种，采用实施例1和对照实施例1-3的培养方法制备液体金针菇菌种，定期取培养液样品进行镜检和对菌丝体形态及状态观察，测定菌丝球数量，并对菌球直径进行测量；菌丝球数量测定：取10ml培养液，过滤获取菌丝球，用蒸馏水清洗3次，将洗净的菌丝球悬浮于100ml蒸馏水中，再从中吸取1ml悬浮液置于平皿中，皿下衬黑白相间方格纸计数，每次处理重复3次，取平均数。菌丝干重的测量：培养好的菌丝体用滤纸过滤后，用蒸馏水冲洗3次，防止烘干且已经称重的培养皿中，电热恒温古风干燥箱中105℃烘干0.5h，直至2次称重的重量差不超过2mg。三、试验结果将金针菇菌种按照上述培养方法进行培养，并对培养结束后测量的菌丝体形态及性状等，测定结果见表1。表1不同制备方法对金针菇液体菌种生长的影响注：1、***表示菌丝球颜色洁白，大小均匀，边缘多毛刺；在显微镜下观察，发现菌丝具有横隔，有锁状联合，菌球由菌丝紧密缠绕而成，**表示菌丝球颜色发黄，结构松散，表面毛刺少，大小不均一。上述试验结果可知，本发明所提供的金针菇液体菌种的制备方法，经过大量试验得到的培养参数，并对发酵过程进行详细分级培养，效果优于单一条件；提供了金针菇菌种生长和发育的良好环境和条件，得到的金针菇液体菌种，品质好，产量高，可实现对金针菇液体菌种的大量制备。试验例2不同培养基对金针菇液体菌种的影响一、试验材料1.1菌种金针菇908，陕西众兴高科生物科技有限公司提供。1.2培养基试验1组：选实施例5所述培养基，试验2组选实施例6所述培养基，试验3组选对照实施例4所述培养基；试验4组选对照实施例5所述培养基；试验5组选对照实施例6所述培养基；其中斜面培养基均为PDA培养基：葡萄糖20g，琼脂18g，马铃薯煮的汁的过滤液1000ml。二、培养方法取上述金针菇菌种及培养基，采用实施例1的培养方法制备液体金针菇菌种，定期取培养液样品进行镜检和对菌丝体形态及状态观察，测定菌丝球数量，并对菌球直径进行测量；菌丝球数量测定：取10ml培养液，过滤获取菌丝球，用蒸馏水清洗3次，将洗净的菌丝球悬浮于100ml蒸馏水中，再从中吸取1ml悬浮液置于平皿中，皿下衬黑白相间方格纸计数，每次处理重复3次，取平均数。菌丝干重的测量：培养好的菌丝体用滤纸过滤后，用蒸馏水冲洗3次，防止烘干且已经称重的培养皿中，电热恒温古风干燥箱中105℃烘干0.5h，直至2次称重的重量差不超过2mg。三、试验结果将金针菇菌种按照上述培养方法进行培养，并对培养结束后测量的菌丝体形态及性状等，测定结果见表2。表2不同培养基对金针菇液体菌种生长的影响试验1组试验2组试验3组试验4组试验5组菌球个数(个/ml)619738512495407菌球直径(mm)1.1-2.01.5-1.90.7-1.61.0-2.80.6-3.1菌丝干重g/100ml1.973.151.581.370.95菌丝球形态************培养液外观############培养液气味+++++++++++杂菌污染情况无无无部分污染部分污染注：1、****表示菌丝球颜色洁白，大小均匀，边缘多毛刺；在显微镜下观察，发现菌丝具有横隔，有锁状联合，菌球由菌丝紧密缠绕而成，***表示菌丝球洁白，表面毛刺少；**表示菌丝球颜色变深，表面毛刺少，结构松散，部分成索状，边缘较为光滑，*表示菌丝球颜色发黄，结构松散，横隔不明显，锁状联合少，多疏松地集合在一起；2、####表示培养液澄清透亮，菌球密集，悬浮均匀；###表示，澄清，菌球密度大，分散较为均匀；##表示较为澄清，菌球密度小；#表示，略有浑浊，菌球密度小，有分层；3、+++表示浓厚的菇香味；++表示菇香气味清；+表示略有酸味；由上述试验结果可知，本发明所提供的液态培养基，实施例6的效果最优，实施例5次之，均明显优于对照例中的培养基；实施例5所提供的培养基所培养的金针菇菌种，菌丝白色浓密，菌种较为均一说明其质量较佳；培养液澄清，菌球密度大达到619个/ml，说明菌种对培养液中的营养物质吸收较为完全，生长状态较佳；实施例6所提供的培养基所培养的金针菇液体菌种，菌球密度更大，可达到738个/ml，产量高，且大小均一，菌球直径均在有效菌种2.0mm内，菌丝球边缘多毛刺，菌丝间具有横隔，有锁状联合，菌球由菌丝紧密缠绕而成，且无杂菌污染，表明该菌株的活性强，质量优；培养液澄清透亮，菌球悬浮均匀，菌株对培养液中的大分子营养物质的分解利用非常完全，生长状态非常好。而对照实施例所提供的培养基，缺少促进生长的因子，即使培养基中基础碳源、氮源及无机盐相同，培养出的菌种数量少，大小不均一，且有老化现象。当前第1页1 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