本发明是关于微生物菌剂的，尤其涉及一种腐殖质还原菌的厌氧培养方法。
背景技术：
传统微生物厌氧培养装置主要包括两种形式：一是化学耗氧，即通过投加化学药剂，利用化学反应消耗装置内氧气，制造厌氧环境；二是采用气瓶向反应器内补充惰性气体或人为制造真空环境。腐殖质还原菌作为一种厌氧菌，广泛存在于河道沉积物及土壤中，而传统厌氧培养装置内环境与实际的底泥-上覆水系统相去甚远；其次，反应器与气瓶联用，不仅增大占地面积，提高菌剂制作成本，并且每次取样时极易造成反应器有氧状态，不能保证严格厌氧环境。
腐殖质还原菌是一类具有腐殖式呼吸能力的微生物，即能够以腐殖质及腐殖质模式物AQDS(蒽醌-2,6-双磺酸钠)为唯一电子受体，氧化多种有机物并支持菌体的生长。腐殖质还原菌广泛存在于有机物含量丰富的河道沉积物、污染的土壤以及废水处理厂的活性污泥中，主要包括Fe(Ⅲ)还原菌、硝酸盐还原菌、硫酸盐还原菌、发酵细菌、嗜热产甲烷古细菌等。
腐殖质还原菌作为一类具有腐殖式呼吸能力的微生物，可以利用有机质作为碳源及电子供体，偶联能量进行生长。腐殖式呼吸作用所产生的还原态腐殖质可以进一步还原环境中的氧化态物质，如Fe(Ⅲ)、Mn(Ⅳ)、Cr(Ⅵ)、U(Ⅵ)、硝基芳香化合物和多卤代污染物。因此，腐殖质呼吸能够影响环境中碳、氮循环及一些痕量金属的生物地球化学循环，并且能够促进重金属以及有机污染物的脱毒，在水体自净、污染土壤及河道沉积物的原位修复、污水处理等方面具有广阔的应用前景，而目前对于腐殖质还原菌的规模化培养仍处于空白阶段。
AQDS(电子传递体)作为一种腐殖质模式物，具有与天然腐殖质相似的醌基结构，但其分子量远远小于土壤及沉积物中的腐殖质，更容易被微生物生长代谢所利用，1mmol/L AQDS可偶联菌体生长约60倍。因此，本发明设计一种厌氧培养方法，采用AQDS培养液，并将培养液循环利用，保证在厌氧环境下进行菌剂的富集生长。
技术实现要素：
本发明的目的，是克服传统腐殖质还原菌的厌氧培养方法的不足，提供一种腐殖质还原菌高效富集培养的新方法。
一种腐殖质还原菌的载体厌氧培养方法，具体步骤如下：
(1)第一培养阶段，培养时间为48h
通过培养液补入口A10向反应器Ⅰ区注入新鲜培养液，并通过自动液位控制装置A11控制液面高度，取污水厂厌氧活性污泥作为接种母液，接种量为反应器Ⅰ区有效容积的30～40％，活性污泥由活性污泥补入口A9进入反应器Ⅰ区开始培养；
培养液由黄色逐渐变为橙红色；单向气体导出口8排除产生的CH4、CO2及N2气体；
培养48h后，通过培养液补入口B14向反应器Ⅱ区注入新鲜培养液，通过自动液位控制装置B15控制液面高度，同时打开阀门A12，菌体及培养液经固液分离器A13，其中菌体进入反应器Ⅱ区进行第二阶段培养，培养液进入曝气池19，当反应器Ⅰ区的菌体及培养液逐渐排空时，关闭阀门A12；控制曝气池19内曝气量为0.3～0.6m3/h，曝气时间0.5～1h，在曝气过程中，培养液由橙红色逐渐变为黄色，其中被还原的AH2QDS逐渐被氧化为AQDS，重新作为电子受体参与电子传递，从而实现了培养液的循环利用；
此外，当反应器Ⅰ区内菌体及培养液逐渐排空后，通过培养液补入口A10向反应器Ⅰ区注入新鲜培养液，通过自动液位控制装置A11控制液面高度；活性污泥由活性污泥补入口9进入反应器Ⅰ区，接种量为反应器Ⅰ区有效容积的30～40％，反应器Ⅰ区重新开始新一轮腐殖质还原菌的第一阶段培养；
(2)第二培养阶段，培养时间为24h
曝气池19中的培养液经离心泵4抽吸至除氧池3中；除氧池3中以亚硫酸盐作为除氧剂，除氧剂通过除氧池3上面的除氧剂补充口1投入其中；培养液在除氧池3中停留1～2h，通过自动液位控制装置2及多向阀门6，经布水管A5和布水管B7，分别有1/2体积培养液进入反应器Ⅱ区及1/2体积培养液进入反应器Ⅲ区；
菌体进入反应器Ⅱ区培养24h后，打开阀门B16，反应器Ⅱ区中菌体及培养液经过固液分离器B17，菌体进入反应器Ⅲ区进行第三阶段培养，培养液进入曝气池19，控制曝气量为0.3～0.6m3/h，曝气时间0.5～1h，当菌体及培养液逐渐排空时，关闭阀门B16；
当反应器Ⅱ区中菌体及培养液排空后，通过培养液补入口B14向反应器Ⅱ区注入新鲜培养液，通过自动液位控制装置B15控制液面高度；
(3)第三培养阶段，培养时间为24h
曝气池19中的培养液经离心泵4抽吸至除氧池3，停留1～2h后，通过自动液位控制装置2及多向阀门6，经布水管B7，全部进入反应器Ⅲ区；培养24h后，打开位于反应器底部阀门20，菌体及培养液进入吸附区21，通过自动液位控制装置C18控制，当液体流尽时，关闭阀门20；
此时，反应器Ⅰ区内菌体已经过48h培养，打开阀门A12，菌体及培养液经固液分离器A13，其中菌体进入反应器Ⅱ区进行第二阶段培养，培养液进入曝气池19进行曝气，当反应器Ⅰ区的菌体及培养液逐渐排空时，关闭阀门A12；控制曝气池19内曝气量为0.3～0.6m3/h，曝气时间0.5～1h，重复步骤2、3，实现腐殖质还原菌的连续培养。
此外，当反应器Ⅰ区内菌体及培养液逐渐排空后，通过培养液补入口A10向反应器Ⅰ区注入新鲜培养液，通过自动液位控制装置A11控制液面高度；活性污泥由活性污泥补入口9进入反应器Ⅰ区，接种量为反应器Ⅰ区有效容积的30～40％，反应器Ⅰ区重新开始新一轮腐殖质还原菌的第一阶段培养；
吸附区21内设置有吸附载体，吸附载体为经研碎且过80目筛并高温灭菌的膨润土，膨润土添加量为吸附区有效容积的1/4；并在其中添加经研碎且过80目筛并高温灭菌的药剂KH2PO4、CaCl2、MgSO4和NaHCO3，药剂的质量比为5：2：1：1，药剂添加的体积量为膨润土添加的体积量的5～10％，将药剂与膨润土混合均匀后平铺于超滤膜上方。菌体及培养液在吸附区21被吸附后，打开排料口22收集菌体，废液经吸附区下端超滤膜23排出。
所述腐殖质还原菌是一类具有腐殖式呼吸能力的微生物，即能够以腐殖质及腐殖质模式物AQDS为唯一电子受体，氧化多种有机物并支持菌体的生长；腐殖质还原菌广泛存在于有机物含量丰富的河道沉积物、污染的土壤以及废水处理厂的活性污泥中，主要包括Fe(Ⅲ)还原菌、硝酸盐还原菌、硫酸盐还原菌、发酵细菌及嗜热产甲烷古细菌；
所述腐殖质模式物AQDS为蒽醌-2、6-双磺酸钠。
述反应器Ⅰ区、反应器Ⅱ区、反应器Ⅲ区的有效容积分别为0.2、0.2、0.4m3。
所述反应器Ⅰ区、反应器Ⅱ区的区域底部隔板的坡度均为3％～5％，以利于活性污泥沉降并通过阀门A12、阀门B16排出。
除氧池3、曝气池19有效容积均为0.2m3，吸附区21有效容积为0.4m3。
布水管A5、布水管B7均为下方单侧开孔，并利用循环培养液从布水管的喷射实现对下方培养区域的水力搅拌，增加菌体与培养液的接触，从而提高菌体表面传质效率。
步骤(1)中所述新鲜培养液为AQDS培养液，主要成分为啤酒废水或糖蜜废水，并向废水中补充AQDS，补充量为40～60g/m3。
步骤(1)中所述反应器Ⅰ区、反应器Ⅱ区注入新鲜培养液的液面高度均为反应器的1/2体积；
除氧池3中的除氧剂选用亚硫酸盐，当除氧池3有效容积为0.2m3时，投入亚硫酸盐药量控制在10～15g。
本发明弥补了腐殖质还原菌规模化培养方法的空白，且与传统厌氧培养方法相比较，避免了补充惰性气体或制造真空环境等手段，操作方法简单。另外，通过曝气池和除氧池的联用，将还原态AH2QDS氧化为AQDS，重新参与电子传递过程，实现了培养液的循环利用，降低了菌剂制作成本。同时，在吸附区采用吸附能力较强的膨润土实现对菌剂的吸附，避免了菌剂流失，为后续菌剂的有效利用提供了保证。
附图说明
图1是腐殖质还原菌厌氧培养装置示意图
附图标记如下：
1———除氧剂补充口 2———自动液位控制装置
3———除氧池 4———离心泵
5———布水管A 6———多向阀门
7———布水管B 8———单向气体导出口
9———活性污泥补入口 10———培养液补入口A
11———自动液位控制装置A 12———阀门A
13———固液分离器A 14———培养液补入口B
15———自动液位控制装置B 16———阀门B
17———固液分离器B 18———自动液位控制装置C
19———曝气池 20———阀门
21———吸附区 22———排料口
23———超滤膜
具体实施方式
下面通过如下实施实例对本发明予以进一步说明。
本实施例的完整的培养周期为96h，包括三个阶段。第一培养阶段为48h，在反应器Ⅰ区内进行，有效容积为0.2m3；第二培养阶段为24h，在反应器Ⅱ区内进行，有效容积为0.2m3；第三培养阶段为24h，在反应器Ⅲ区内进行，有效容积为0.2m3；每个周期培养结束后，约有0.3m3的菌体及培养液进入吸附区，采用膨润土进行吸附。
培养液为AQDS培养液，主要成分为啤酒废水或糖蜜废水，并向废水中补充AQDS作为电子受体，补充量控制在40～60g/m3，注入培养液体积为0.1m3，故AQDS补充量控制为6g。
具体步骤如下：
(1)第一培养阶段，培养时间为48h
通过培养液补入口A10向反应器Ⅰ区注入新鲜培养液，当液面高度达到自动液位控制装置11设定高度，即反应器Ⅰ区1/2体积时停止。取污水厂厌氧活性污泥作为接种母液，接种量为0.08m3，活性污泥由补入口9进入反应器Ⅰ区开始培养。培养过程中，厌氧微生物以柠檬酸钠为碳源及电子供体，AQDS为电子受体进行醌呼吸，电子在细胞膜呼吸链的传递过程中，偶联产生能量支持菌体生长。随着腐殖质还原菌的增殖代谢，AQDS接受电子被还原为AH2QDS，培养液由黄色逐渐变为橙红色。通过单向气体导出装置8排除产生的CH4、CO2及N2等气体。
培养48h后，通过培养液补入口B14向反应器Ⅱ区注入新鲜培养液，当液面高度达到自动液位控制装置15设定高度，即反应器Ⅱ区1/2体积时停止。同时打开阀门A12，菌体及培养液经固液分离器A13，其中菌体进入反应器Ⅱ区进行第二培养阶段培养，培养液进入曝气池19，当菌体及培养液逐渐排空时，关闭阀门A12。控制曝气池内曝气量为0.6m3/h，曝气时间1h，在曝气过程中，培养液由橙红色逐渐变为黄色，其中被还原的AH2QDS逐渐被氧化为AQDS，可重新作为电子受体参与电子传递，从而实现了培养液的循环利用。
此外，当反应器Ⅰ区内菌体及培养液逐渐排空后，通过培养液补入口A10向反应器Ⅰ区注入新鲜培养液，当液面高度达到自动液位控制装置A11设定高度，即反应器Ⅰ区1/2体积时停止。活性污泥由补入口9进入反应器Ⅰ区，接种量为0.08m3，反应器Ⅰ区重新开始新一轮腐殖质还原菌的第一阶段培养。
(2)第二培养阶段，培养时间为24h
从菌体进入反应器Ⅱ区开始计时；
曝气池19中的培养液经离心泵4抽吸至除氧池3中，曝气池(19)与除氧池3的有效容积均为0.2m3；除氧池3中以亚硫酸盐作为除氧剂，药剂投加量为15g。亚硫酸盐被氧化后，培养液中适当硫酸盐含量可促进腐殖质还原菌利用AQDS作为电子受体进行生长代谢。培养液在除氧池3中停留2h，通过自动液位控制装置2及多向阀门控制6，经布水管A5、布水管B7，分别有1/2体积培养液进入反应器Ⅱ区及1/2体积培养液进入反应器Ⅲ区。布水管A5、布水管B7均为下方单侧开孔，并利用循环培养液从布水管的喷射实现对下方培养区域的水力搅拌，增加菌体与培养液的接触，从而提高菌体表面传质效率。
菌体培养24h后，打开阀门B16，反应器Ⅱ区中菌体及培养液经过固液分离器B17，菌体进入反应器Ⅲ区进行第三培养阶段培养；培养液进入曝气池19，控制曝气量为0.6m3/h，曝气时间1h，当菌体及培养液逐渐排空时，关闭阀门B16。
此外，当反应器Ⅱ区中菌体及培养液排空后，通过培养液补入口B14向反应器Ⅱ区注入新鲜培养液，当液面高度达到自动液位控制装置15设定高度，即反应器Ⅱ区1/2体积时停止。
(3)第三培养阶段，培养时间为24h
从菌体进入反应器Ⅲ区开始计时。
曝气池中的培养液经离心泵4抽吸至除氧池3，停留2h后，通过通过自动液位控制装置2及多向阀门控制6，经布水管B7，全部进入反应器Ⅲ区。
菌体培养24h后，打开位于反应器底部阀门20，菌体及培养液进入吸附区21，通过自动液位控制装置18控制，当液体流尽时，关闭阀门20。
此时，反应器Ⅰ区内菌体已经过48h培养，打开阀门A12，菌体及培养液经固液分离器A13，其中菌体进入反应器Ⅱ区进行第二阶段培养，培养液进入曝气池19进行曝气，当反应器Ⅰ区的菌体及培养液逐渐排空时，关闭阀门A12；控制曝气池19内曝气量为0.3～0.6m3/h，曝气时间0.5～1h，重复步骤2、3，实现腐殖质还原菌的连续培养。
此外，当反应器Ⅰ区内菌体及培养液逐渐排空后，通过培养液补入口A10向反应器Ⅰ区注入新鲜培养液，通过自动液位控制装置A11控制液面高度；活性污泥由活性污泥补入口9进入反应器Ⅰ区，接种量为反应器Ⅰ区有效容积的30～40％，反应器Ⅰ区重新开始新一轮腐殖质还原菌的第一阶段培养。
吸附区21有效容积为0.4m3，吸附区21内设置有吸附载体，吸附载体为经研碎过80目筛并高温灭菌的膨润土，添加量为0.1m3；并在其中添加经研碎研碎过80目筛并高温灭菌的药剂KH2PO4、CaCl2、MgSO4、NaHCO3，质量比为5：2：1：1，添加量为膨润土量的5％。
菌体及培养液在吸附区21被吸附后，打开排料口22收集菌体，废液经吸附区下端超滤膜23排出。