专利名称：一种快速分离厌氧微藻的方法
技术领域：
本发明涉及微藻的分离方法，具体的说是一种快速分离厌氧微藻的方法。
背景技术：
微藻是一种生物制氢的重要材料，在其生产氢气的过程中必须给予一个严格的厌氧环境，防止氢气与氧气结合。蓝藻细胞主要依靠固氮酶释放氢气，只要去除铵离子，氮气等底物以及氧气，就可以在厌氧环境下持续产氢。对于绿藻，目前常用的技术方法是"间接生物光解"法，首先正常培养绿藻细胞，使之靠光合作用累积自身所需的碳水化合物；然后将收获的绿藻细胞培养在缺硫的培养基中，此后PSII活性很快丧失，而线粒体的呼吸作用几乎不受影响，导致培养基中的02逐渐被呼吸作用消耗掉，氢酶活性达到最大，从而得到了较高的产氢量。一段时间后再将第二阶段的细胞转移到正常培养基中，重新进"第一阶段"，如此周而复始。然而，不管是蓝藻的固氮酶还是绿藻的氢酶，它们对氧气都是极其敏感的，氧气的发生会极大地限制氢气产量。但是严格的厌氧环境反过来又会抑制微藻细胞的生长，使得操作技术复杂化。如果能够找到在厌氧环境下快速生长的微藻藻种，那么不仅可以大大减少操作技术的复杂性，而且也能获得较高的氢气产量。随着微藻作为生物制氢的材料越来越受到重视，分离培养这种具有厌氧生长能力的微藻藻种具有重要的潜在应用价值。 厌氧微藻作为一类特殊的生物群体，反应了生物从无氧环境到有氧环境的生物进化历程，因此是生命进化树上的重要一环，具有重要的研究价值。 厌氧微生物的分离培养已有许多成熟的技术，比如亨盖特滚管技术，厌氧培养箱操作技术等等，但是这些方法操作复杂，成本高昂，不适合于快速地分离鉴定厌氧微藻。
发明内容
本发明目的在于提供一种快速分离厌氧微藻的方法。
为实现上述目的本发明采用的技术方案为 —种快速分离厌氧微藻的方法将待分离样品加入盛有TAP培养基的器皿中，然后用灭菌的液体石蜡密封，置于光照培养箱中以25或3(TC，40iimo1 m—2 s—1条件下培养直至上层液体变成绿色，使待分离样品充分富集生长，待用；取上述富集培养的待分离样品lml，稀释至10—5， 10—6和10—7三个稀释度，将三个梯度的待分离样品分别涂于加入1. 5%琼脂、冷却的TAP培养基上，然后再铺一层加入1. 5%琼脂的TAP培养基，而后再铺一层低熔点固体石蜡，使其处于密封厌氧状态，倒置于光照培养箱中以25或30°C ， 40 ii mol m—2 s一1条件下培养5-10天； 若上述培养基中出现蓝色或绿色藻落，即为待分离样品中存在厌氧微藻；若上述
培养基中没有出现蓝色或绿色藻落，即为待分离样品中不存在厌氧微藻。 所述培养基中出现蓝色或绿色藻落，将培养基上固体石蜡去掉，用巴氏吸管将蓝
色或绿色藻落吸出至TAP液体培养基中培养，待颜色变绿后，将藻落加入盛有TAP培养基的器皿中，然后用灭菌的液体石蜡密封，置于光照培养箱中以25或30°C ， 40 mol m—2 s一1 条件下培养直至上层液体变成绿色，使待分离样品充分富集生长，待用；取上述富集培养 的待分离样品lml，稀释至10—5，10—6和10—7三个稀释度，将三个梯度的待分离样品分别涂 于加入1. 5%琼脂、冷却的TAP培养基上，然后再铺一层加入1. 5%琼脂的TAP培养基，而 后再铺一层低熔点固体石蜡，使其处于密封厌氧状态，倒置于光照培养箱中以25或30°C ， 40 mol *m—2 s—1条件下培养5_10天，为一个周期，如此重复3至4个周期；即获得纯化后 藻液。 所述纯化后藻液接种于TAP培养基中，加入终浓度为lmg/L的刃天青作为厌氧指 示剂，另外加入终浓度为O. 1% (m/m)的连二亚硫酸钠作为除氧剂，而后将其处于厌氧状 态，置于光照培养箱中培养至培养基变为蓝色或绿色，取藻落加入连二亚硫酸钠，若蓝色或 绿色不褪去，表明分离到的微藻已经生长，属于厌氧微藻。 所述厌氧状态为将培养基密封后迅速充入高纯氮气一分钟，刃天青由蓝色变为无 色，即为厌氧状态。所述涂布有待分离样品的加入1.5X琼脂的TAP培养基，于12rC灭菌20min，冷 却后涂布；再涂布有待分离样品的加入1. 5X琼脂的TAP培养基上再铺的加入1. 5%琼脂的 TAP培养基于12rC灭菌20min，冷却至45。C，待用；所述低熔点固体石蜡为6(TC石蜡。
本法发明所具有的优点 本发明可快速分离厌氧微藻，其利用简单的"三明治"夹层培养法，在短时间内获 得厌氧微藻单克隆，方法简单，实用性强，同时结合简单的厌氧培养方法，可以快速确定所 得微藻是否在厌氧条件下生长。
图1为本发明的"三明治"平板(其中1.琼脂一层；2.琼脂二层；3.石蜡层；4.培
养皿)。 图2为采用本发明方法分离出的微藻藻株GXNN01在厌氧平板上的单克隆藻落。
图3为基于18S rRNA基因序列的进化树，以Chlamydomonasreinhardtii CC-1952 为外源对照。 图4基于ITS(内含子间隔区)序列的进化树，以Chlamydomonasreinhardtii SAG 11-32b为外源对照。 图5A为采用本发明方法分离出的微藻藻株GXNN 01的光镜照片。 图5B为采用本发明方法分离出的微藻藻株GXNN 01的扫描电镜照片。 图5C为采用本发明方法分离出的微藻藻株GXNN 01的透射电镜照片。 图6为采用本发明分离出的微藻藻株GXNN 01在添加苹果酸条件下的混养有氧和
混养厌氧生长曲线，以及自养条件下的生长曲线。
具体实施方式
实施例1 待分离样品从广西省南宁市淀粉加工厂的一处污水处理池中，用取样器取少量底 层污泥和污水，装入无菌瓶中，盖紧盖子，命名为GXNN01，密封后带回实验室置于四度保存。
4取少量污泥接种于盛有TAP培养基的三角瓶中，上面覆盖一层液体石蜡，用丁基橡胶塞盖 紧，置于光照培养箱中，于3(TC，40i!mo1 m—2 s—1条件下培养直至上层液体变成绿色。取 上层培养基lmL，加入至9mLTAP培养基中，进行十倍梯度稀释至10—5， 10—6和10—7三个稀释 度的藻液，而后将3个梯度的澡液分别涂于"三明治"平板(参见图1)上。所述"三明治" 为澡液涂布于加入1.5X琼脂的、冷却的TAP培养基上，然后再铺一层加入1.5%琼脂的 TAP培养基，而后再铺一层低熔点固体石蜡，使其处于密封厌氧状态，即为"三明治"平板，而 后将涂好的平板倒置于光照培养箱中30°C ， 40 i！ mol m—2 s—1条件下培养。约5天后平板 中央长出现蓝色或绿色单藻落(参见图2)。即为待分离样品中不存在厌氧微藻。
在无菌台中用镊子轻轻将上述培养基上层的石蜡剥落，并用接种环扎进琼脂层挑 取单藻落至TAP液体培养基中培养，待颜色变绿后，将藻落加入承有TAP培养基的器皿中， 然后用灭菌的液体石蜡密封，置于光照培养箱中以3(TC，40iimo1 m—2 s—1条件下培养直 至上层液体变成绿色，使待分离样品充分富集生长，待用；取上述富集培养的待分离样品 lml，稀释至10—5，10—6和10—7三个稀释度，将三个梯度的待分离样品分别涂于加入1. 5%琼 脂、冷却的TAP培养基上，然后再铺一层加入1. 5%琼脂的TAP培养基，而后再铺一层低熔点 固体石蜡，使其处于密封厌氧状态，倒置于光照培养箱中以3(TC，40iimo1 m—2 s—1条件下 培养约5天，为一个周期，如此重复3周期；即获得纯化后藻液。 取获得纯化后藻液接种于TAP培养基中，加入过滤除菌的10%连二亚硫酸钠储液 (终浓度0. 1% )和lmg/mL的刃天青储液(终浓度lmg/L)，而后将培养基密封后迅速充入 高纯氮气一分钟，刃天青由蓝色变为无色，其处于厌氧状态，置于光照培养箱中培养5天， 培养基变为蓝色或绿色，取藻落加入连二亚硫酸钠，若蓝色或绿色不褪去，表明分离到的微 藻已经生长，属于厌氧微藻。 利用通用引物进行PCR，扩增了该藻的18S rRNA基因和内含子间隔区(ITS)序列， 并对其进行了测序，经Blast比对，做进化树分析表明该微藻是隶属于绿藻门的Chlorella sorokiniana GXNN01 (参见图3、图4)。 对该藻的细胞结构进行了光镜，扫描电镜和透射电镜分析(参见图5A、图5B、图 5C)，光镜分析表明该藻是单细胞微藻，呈圆形或椭圆形，细胞大小在2. 1 m到5. 6 m之 间，细胞内部被一个杯状的叶绿体填充，叶绿体内有蛋白核和淀粉粒，生殖方式通过似亲孢 子生殖， 一个细胞放散四个小孢子。 对该藻的生长曲线(参见图6)的分析表明，该藻具有在有氧和厌氧条件下快速生 长的能力。在自养条件下，生长周期漫长，在12d之后才进入稳定期；在添加苹果酸并且有 氧气条件下，该藻能快速生长，仅5d就进入稳定期，而且在厌氧条件下保持着相同生长速 度但细胞密度有所降低。同时，该藻还可以利用葡萄糖，乙酸盐，果糖，琥珀酸，延胡索酸丙 酮酸等进行异养或混养生长。 对该藻的生化成分进行分析表明，在自养条件下蛋白质含量可达75%细胞干重， 在以乙酸盐作为碳源进行异养生长时脂肪含量可达28%细胞干重，因此具有重要的应用价 值，既可作水产饵料又可当作生物制氢和生物柴油的反应器。
实施例2 将待分离样品加入承有TAP培养基的器皿中，然后用灭菌的液体石蜡密封，置于 光照培养箱中以30°C ， 40 mol *m—2 s—1条件下培养直至上层液体变成绿色，使待分离样品充分富集生长，待用；取上述富集培养的待分离样品lml，稀释至10—5，10—6和10—7三个稀释
度，将三个梯度的待分离样品分别涂于加入1.5X琼脂、冷却的TAP培养基上，然后再铺一
层加入1. 5%琼脂的TAP培养基，而后再铺一层低熔点固体石蜡，使其处于密封厌氧状态，
倒置于光照培养箱中以30°C ， 40 i！ mol m—2 s—1条件下培养6_7天； 上述培养基中没出现蓝色或绿色藻落，即为待分离样品中不存在厌氧微藻。
权利要求
一种快速分离厌氧微藻的方法，其特征在于将待分离样品加入盛有TAP培养基的器皿中，然后用灭菌的液体石蜡密封，置于光照培养箱中以25或30℃，40μmol·m-2·s-1条件下培养直至上层液体变成绿色，使待分离样品充分富集生长，待用；取上述富集培养的待分离样品1ml，稀释至10-5，10-6和10-7三个稀释度，将三个梯度的待分离样品分别涂于加入1.5％琼脂、冷却的TAP培养基上，然后再铺一层加入1.5％琼脂的TAP培养基，而后再铺一层低熔点固体石蜡，使其处于密封厌氧状态，倒置于光照培养箱中以25或30℃，40μmol·m-2·s-1条件下培养5-10天；若上述培养基中出现蓝色或绿色藻落，即为待分离样品中存在厌氧微藻；若上述培养基中没有出现蓝色或绿色藻落，即为待分离样品中不存在厌氧微藻。
2. 按权利要求1所述的快速分离厌氧微藻的方法，其特征在于所述培养基中出现蓝 色或绿色藻落，将培养基上固体石蜡去掉，用巴氏吸管将蓝色或绿色藻落吸出至TAP液体 培养基中培养，待颜色变绿后，将藻落加入盛有TAP培养基的器皿中，然后用灭菌的液体石 蜡密封，置于光照培养箱中以25或3(TC，40iimo1 m—2 s—1条件下培养直至上层液体变成 绿色，使待分离样品充分富集生长，待用；取上述富集培养的待分离样品lml，稀释至10—5， 10一6和10—7三个稀释度，将三个梯度的待分离样品分别涂于加入1.5X琼脂、冷却的TAP培 养基上，然后再铺一层加入1.5X琼脂的TAP培养基，而后再铺一层低熔点固体石蜡，使其 处于密封厌氧状态，倒置于光照培养箱中以25或30°C ， 40 mol m—2 s—1条件下培养5_10 天，为一个周期，如此重复3至4个周期；即获得纯化后藻液。
3. 按权利要求2所述的快速分离厌氧微藻的方法，其特征在于所述纯化后藻液接种 于TAP培养基中，加入终浓度为lmg/L的刃天青作为厌氧指示剂，另外加入终浓度为0. 1% (m/m)的连二亚硫酸钠作为除氧剂，而后将其处于厌氧状态，置于光照培养箱中培养至培养 基变为蓝色或绿色，取藻落加入连二亚硫酸钠，若蓝色或绿色不褪去，表明分离到的微藻已 经生长，属于厌氧微藻。
4. 按权利要求3所述的快速分离厌氧微藻的方法，其特征在于所述厌氧状态为将培 养基密封后迅速充入高纯氮气一分钟，刃天青由蓝色变为无色，即为厌氧状态。
5. 按权利要求1所述的快速分离生长厌氧微藻的方法，其特征在于所述涂布有待分 离样品的加入1. 5%琼脂的TAP培养基，于12rC灭菌20min，冷却后涂布；再涂布有待分离 样品的加入1.5X琼脂的TAP培养基上再铺的加入1.5X琼脂的TAP培养基于12rC灭菌 20min，冷却至45t:，待用；所述低熔点固体石蜡为6(TC石蜡。
全文摘要
本发明涉及微藻的分离方法，具体的说是一种快速分离厌氧微藻的方法。将待分离样品加入盛有TAP培养基的器皿中，然后用灭菌的液体石蜡密封，置于光照培养箱中培养直至上层液体变成绿色，使待分离样品充分富集生长，待用；取上述富集培养的待分离样品1ml，稀释至10-5，10-6和10-7三个稀释度，将三个梯度的待分离样品分别涂于加入1.5％琼脂、冷却的TAP培养基上，然后再铺一层加入1.5％琼脂的TAP培养基，而后再铺一层低熔点固体石蜡，使其处于密封厌氧状态，倒置于光照培养箱中培养5-10天；若出现蓝色或绿色藻落，即为存在厌氧微藻；若没有出现蓝色或绿色藻落，即为不存在厌氧微藻。本发明可在短时间内获得厌氧微藻，方法简单，实用性强。
文档编号C12R1/89GK101709267SQ20091023054
公开日2010年5月19日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者乔洪金, 张晓娟, 朱大玲, 潘光华, 王广策 申请人:中国科学院海洋研究所