一种结直肠癌易感基因检测分型试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及一种检验技术领域，具体是一种结直肠癌易感基因检测分型试剂盒及其应用。

背景技术：

随着人类基因组计划(humangenomeproject，hgp)的完成，大量疾病相关基因的发现，促进了传统生物医学模式向可预测性、可预防性、个体化和参与性的基因组医学模式转变，为未来发展预防、诊断、治疗长期困扰人类的诸如癌症、心脑血管疾病、糖尿病、神经和精神疾病等重大复杂性疾病开辟了新途径，也为基因科学的产业化提供了良好的机遇。

全基因组关联分析(genomewideassociationstudies，gwas)是应用人类基因组中数以百万计的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)为标记进行病例一对照关联分析，即在一定人群中收集病例组和对照组dna，进行snps芯片扫描，采用关联分析比较受检snps标记的某一等位基因频率在病例组和对照组间有无显著性差异，筛选与疾病关联的基因序列变异，做出该snps是否与疾病关联的判断，预测疾病的患病率及风险。该方法研究前不需构建任何假设，不再局限于候选基因或候选染色体区域作为关联分析对象，而是针对基因组中所有snps，随机进行基因分型，分析snps与疾病的关联度，可在全基因组水平上，开展多中心、大样本、反复验证的基因与疾病的关联研究，全面及时疾病发生、发展和治疗的相关遗传基因。

目前发现遗传因素，或其与环境因素之间的相互作用参与了几乎所有的人类疾病的发生过程。一些复杂的疾病往往不是由单一基因突变引起的，其发生发展与多基因多位点变异有关，且这些位点的变异可能与环境因素相关，这些位点可提高或降低个体患某种疾病的相对风险，被称为该种疾病的易感位点。根据大量的gwas结果，已经发现并证明的一系列复杂疾病的易感位点已被普遍应用于基因检测领域。

结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一。近年来，结肠癌在中国的发病率呈明显上升趋势，这一变化可能与生活方式和饮食习惯的西方化密切相关，如与高脂，低纤维饮食，肥胖，吸烟饮酒，缺乏运动等因素有关(bolandcr,goela.microsatelliteinstabilityincolorectalcancer[j].gastroenterology,2010,(318):2073-2087.)。国内外学者已经普遍认识到结肠癌的发生是一个多阶段发展的过程，涉及多个癌基因的激活和抑癌基因的失活。个体遗传因素和环境的相互作用是结肠癌发生发展的主要原因。随着健康意识的不断增强，重视健康查体的人也越来越多，但由于医疗资源的制约和结肠镜检查具有痛苦和风险性，使得许多人望而却步。随着国家精准医疗以及体检方式的发展，安全有效的基因检测无疑成为最合适的检测手段。

细胞周期蛋白质包括周期蛋白a，b，d，e，g及h。它们与蛋白质激酶(细胞周期蛋白依赖性激酶,cyclin-dependentkinases,cdks)结合，并调节它们的酶活性，从而帮助推动和协调细胞周期的进行。在整个细胞周期中，细胞的形态变化与细胞内各种生化、生理的周期变化是一致的，但不同的细胞其细胞周期长短却不一致，短的仅为数小时，长的则达几十年，这主要决定于g1期。cyclind2(ccnd2)作为细胞周期cyclin家族的一个成员，与cyclind1,3等同为细胞周期调控蛋白，他们的异常表达导致细胞的异常增殖。已有研究表明，cnnd2在结肠癌肿瘤组织中存在异常表达(ikedak,mondent,tsujiem,etal.cyclind,cdk4andp16expressionincolorectalcancer.[j].nipponrinshojapanesejournalofclinicalmedicine,1996,54(4):1054-9.)，而在正常的结肠上皮细胞中未能检测到ccnd2表达(bartkovaj,thullbergm,slezakp,etal.aberrantexpressionofg1-phasecellcycleregulatorsinflatandexophyticadenomasofthehumancolon.[j].gastroenterology,2001,120(7):1680-8.)。

tbx3(t-box3)基因位于人染色体12号短臂2区4带1亚带，其编码的蛋白含有723个氨基酸(washkowitzaj,gavrilovs,begums,etal.diversefunctionalnetworksoftbx3,indevelopmentanddisease[j].wileyinterdisciplinaryreviewssystemsbiology&medicine,2012,4(3):273–283.)。tbx(t-box)作为一个保守的转录因子家族，通过其t-box区与靶基因启动子的特殊结合位点t-half-site相结合，发挥其生物学功能(renardca,labalettec,armengolc,etal.tbx3isadownstreamtargetofthewnt/beta-cateninpathwayandacriticalmediatorofbeta-cateninsurvivalfunctionsinlivercancer.[j].cancerresearch,2007,67(3):901-10.)。研究表明，tbx3在多种恶性肿瘤中异常表达，高表达的tbx3通过上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition，emt)、肿瘤干细胞(cancerstemcells，csc)和甲基化等多种致癌途径促进肿瘤生长、侵袭及转移。同时也有研究表明在结肠癌细胞系中高度表达(aminis,fathif,mobalegij,etal.theexpressionsofstemcellmarkers:oct4,nanog,sox2,nucleostemin,bmi,zfx,tcl1,tbx3,dppa4,andesrrbinbladder,colon,andprostatecancer,andcertaincancercelllines[j].anatomy&cellbiology,2014,47(1):1-11.)。

pitx1基因是于1996年lamonerie等在果蝇中发现的一种激活阿片黑皮质素前体转录的基因，参与脑垂体，鳃弓衍生及发展，也可能与棘的形成有关，是牙上皮的早期标记分子，在肢体的发育过程中起重要作用(lordrv,brabenderj,wickramasinghek,etal.increasedcdx2anddecreasedpitx1homeoboxgeneexpressioninbarrett'sesophagusandbarrett's-associatedadenocarcinoma.[j].surgery,2005,138(5):924-31.)。kolfschoten等新近发现pitx1在前列腺癌，膀胱癌等肿瘤中低表达，抑制pitx1的表达能诱导人原始细胞的致癌信号，激活ras活性，导致细胞无限增殖。同时kolfschoten等还发现在结肠癌细胞系中pitx1呈低表达,pitx1的重新表达可以改变肿瘤的发生发展(kolfschotenigm,leeuwenbv,bernsk,etal.ageneticscreenidentifiespitx1asasuppressorofrasactivityandtumorigenicity[j].cell,2005,121(6):849-58.)。

因此，对ccnd2、tbx3、pitx1三个与结肠癌相关基因的多态性位点进行检测，能了解个体在结肠癌方面的遗传因素，评估结肠癌发病的相对风险，对于结肠癌早期诊断、早期治疗、早期干预具有积极的意义。同时还能辅助结肠癌的诊断，指导合理用药，帮助预测后代患病风险等。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种结直肠癌易感基因检测分型试剂盒及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种结直肠癌易感基因检测分型试剂盒，所述试剂盒中包括dna提取试剂盒、dna扩增试剂盒和测序试剂盒；所述dna提取试剂盒采用天根生化科技有限公司的dp322型产品，所述dna扩增试剂盒主要包括扩增引物、酶、pcrbuffer、dntpmixture、扩增引物，所述扩增引物为：1)f：5'-ccgagttctttcgctttctg-3'，r：5'-ttaaagagggtttcgcatgg-3',2)f：5'-cagttcccagattggctgtt-3'，r：5'-gcacatgcattttgcacttt-3',3)f：5'-ccttggcacagggaagagta-3',r：5'-ctcactgacaccgagcacat-3'；所述酶采用宝生物工程有限公司的takarataq^tm酶；所述测序试剂盒采用美国abi公司的terminatorv3.1cyclesequencingkit。

作为本发明进一步的方案：所述扩增引物为基于基因ccnd2、tbx3和pitx1进行设计合成的。

一种结直肠癌易感基因检测分型试剂盒的应用，具体步骤为：

(1)首先，将采集回来的样本按照dna提取试剂盒提取获得样本基因组dna；

(2)然后，将获得样本基因组dna使用dna扩增试剂盒进行扩增，得到扩增后的产物，随后将扩增后的产物进行电泳检测和纯化，得到纯化后的产物；

(3)接着，在纯化后的产物中加入测序试剂盒进行桑格测序反应；

(4)最后，将上述步骤桑格测序反应结束后的产物进行乙醇/edta纯化，纯化后上样到测序仪中，序列分析后进行分型判定。

作为本发明进一步的方案：步骤(1)中样本为口腔黏膜细胞。

作为本发明进一步的方案：步骤(4)中乙醇/edta纯化具体为从pcr仪上取下反应板，3800rpm离心1min；加2.5μl0.125medta，短离心；静置5min；加20μl预冷无水乙醇，贴封口膜，振荡混匀；3800rpm，4℃离心30min；离心结束后立即，倒置pcr板低速离心片刻，转速不超过800rpm；加60μl75％的预冷乙醇，贴膜，振荡混匀；3800rpm，4℃离心15min；离心结束后立即，倒置pcr板低速离心片刻，转速不超过800rpm；pcr仪变性程序处理5min，或避光静置30min，挥发乙醇；加10μlhi-di甲酰胺，贴膜，短离心；95℃变性5min；迅速置于-20℃冰箱。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明制备出一种结直肠癌易感基因检测分型试剂盒对ccnd2、tbx3、pitx1三个与结肠癌相关基因的多态性位点进行检测，能了解个体在结肠癌方面的遗传因素，评估结肠癌发病的相对风险，对于结肠癌早期诊断、早期治疗、早期干预具有积极的意义；同时还能辅助结肠癌的诊断，指导合理用药，帮助预测后代患病风险等；本专利产品采用基因检测领域的金标准——桑格测序法进行基因分型；桑格测序法是通过控制dna的合成来产生终止于靶序列特定位点的寡核苷酸片段；首先，合成的寡核苷酸引物同单链的dna模板退火，设立四种不同的测序反应，每一种反应中都含有dna聚合酶和四种正常的dntp；除此之外，还含有少量的有3'-h取代普通脱氧核糖3'-oh的2',3'-ddntp；若ddntp掺入到延伸中的dna链，由于缺少3'-oh将会阻断后续dntp形成磷酸二酯键，dna的进一步延伸被终止；使用四种不同的ddntp，产生的寡核苷酸将终止于每一个a,c,g或t在模板链上占据的位置，将四种反应产生的寡核苷酸加到测序仪中，由于寡核苷酸片段的大小不同，泳动的速率就不同，测序仪的图像控制器按照寡核苷酸经过的时间顺序，便可以检测出新合成链5'到3'的序列信息。

附图说明

图1为本发明的风险纯合型gg测序分型结果图；

图2为本发明的正常纯合型aa测序分型结果图；

图3为本发明的杂合型ac测序分型结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

一种结直肠癌易感基因检测分型试剂盒，所述试剂盒中包括dna提取试剂盒、dna扩增试剂盒和测序试剂盒；所述dna提取试剂盒采用天根生化科技有限公司的dp322型产品，所述dna扩增试剂盒主要包括扩增引物、酶、pcrbuffer、dntpmixture、扩增引物，所述扩增引物为：1)f：5'-ccgagttctttcgctttctg-3'(seqidno.1)，r：5'-ttaaagagggtttcgcatgg-3'(seqidno.2),2)f：5'-cagttcccagattggctgtt-3'(seqidno.3)，r：5'-gcacatgcattttgcacttt-3'(seqidno.4),3)f：5'-ccttggcacagggaagagta-3'(seqidno.5),r：5'-ctcactgacaccgagcacat-3'(seqidno.6)；所述酶采用宝生物工程有限公司的takarataq^tm酶；所述测序试剂盒采用美国abi公司的terminatorv3.1cyclesequencingkit。

所述扩增引物为基于基因ccnd2、tbx3和pitx1进行设计合成的；其中，检测的目标snp位点包括rs3217901、rs59336和rs647161，这3个位点分别位于基因ccnd2、tbx3和pitx1。

一种结直肠癌易感基因检测分型试剂盒的应用，具体步骤为：

(1)首先，将采集回来的样本按照dna提取试剂盒提取获得样本基因组dna；

(2)然后，将获得样本基因组dna使用dna扩增试剂盒进行扩增，得到扩增后的产物，随后将扩增后的产物进行电泳检测和纯化，得到纯化后的产物；

(3)接着，在纯化后的产物中加入测序试剂盒进行桑格测序反应；

(4)最后，将上述步骤桑格测序反应结束后的产物进行乙醇/edta纯化，纯化后上样到测序仪中，序列分析后进行分型判定。

其中：

步骤(1)中样本为口腔黏膜细胞。

步骤(2)中使用dna扩增试剂盒进行扩增，扩增的反应体系为：

takarataqtm(5u/μl)1u

10×pcrbuffer(mg2+)5μl

dntpmixture(2.5mmeach)4μl

正向引物(10pmol/μl)0.5μl

反向引物(10pmol/μl)0.5μl

模板1μl

双蒸水upto50μl，

扩增程序为：

stage1:predegeneration

repeat:1time

95℃3minutes

stage2:pcrreaction

repeat:30cycles

95℃5second

55℃30second

72℃1minutes

stage3:finalextension

72℃5minutes。

步骤(2)中电泳检测和纯化，其中电泳检测具体步骤为：制备1％的琼脂糖凝胶：称一定量的琼脂糖粉加入对应体积的10×tae加热熔解琼脂糖，待其完全熔解后加入10000×goldviewⅰ。待胶凝固后，取5μl的pcr产物加入loadingbuffer混合后，点到胶孔内，120v定压，跑15min左右。在tgreentransilluminator内观察扩增产物的片段大小、单一性及扩增浓度；

其中纯化体系为：

pcr扩增后的反应液5μl

sap/cip(1u/μl)1μl

exoⅰ(5u/μl)1μl

ddh2o3μl，

其中纯化反应程序为：

37℃30minutes

75℃15minutes。

步骤(3)中的桑格测序反应，反应体系为：

bigdye混合液1μl

测序引物(3.2pmol/μl)1μl

模板(纯化产物)1μl

ddh2o2μl，

反应程序为：

stage1:1time

95℃2minutes

stage2:25cycles

95℃10second

50℃5second

60℃4minutes。

步骤(4)中乙醇/edta纯化具体为从pcr仪上取下反应板，3800rpm离心1min；加2.5μl0.125medta，短离心；静置5min；加20μl预冷无水乙醇，贴封口膜，振荡混匀；3800rpm，4℃离心30min；离心结束后立即，倒置pcr板低速离心片刻，转速不超过800rpm；加60μl75％的预冷乙醇，贴膜，振荡混匀；3800rpm，4℃离心15min；离心结束后立即，倒置pcr板低速离心片刻，转速不超过800rpm；pcr仪变性程序处理5min，或避光静置30min，挥发乙醇；加10μlhi-di甲酰胺，贴膜，短离心；95℃变性5min；迅速置于-20℃冰箱。

结果检测判定：

分型判定标准如下，见表1。

表1

其中rs3217901的杂合型gt、rs59336的杂合型ct和rs647161的正常纯合型gg，测序分型结果图，见图1-3.

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。