具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的制备方法及其菌剂与流程

本发明涉及污海水的处理技术领域，特别是涉及一种具有污海水脱氮能力的弧菌，以及该弧菌的用途，以及用该弧菌制备生物脱氮菌剂的方法及其菌剂。

背景技术：

目前，在高密度的养殖体系中，饲料中约75％～80％的氮会进入养殖水体中，并以氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮的形式出现不同程度的累积，对水产养殖动物造成危害，从而限制了海水养殖的单位产量，并且其排放的废水中也含有丰富的含氮化合物，会加快海水富营养化，造成赤潮灾害，给近岸海洋生态环境带来危害。

污海水脱氮菌简单的说是一类能在好氧条件下进行反硝化的细菌。它的存在使得硝化过程和反硝化过程得以在同一个反应器中同步进行，硝化反应的产物可成为反硝化反应的底物，加快了反应速度，降低了运行成本，同时反硝化反应释放的OH^-会补偿硝化反应消耗的碱，避免酸性物质的积累，维持系统pH值的稳定。

已知技术，如已公开的中国专利申请201210152921.0一株耐冷假单胞菌Den-05及其筛选方法和应用，采用微生物纯培养技术从自然生境中筛选出低温好氧反硝化菌PseudomonaspsychrophiliaDen-05，实现了生物脱氮菌剂的制备，为生物强化体系提供了高效脱氮菌种，并通过缩短厌氧周期进而缩短曝气周期的调控方式，提高了城市污水厂冬季脱氮效果，实现了好氧条件下硝酸盐氮的去除。

还有，中国专利201410397855.2一株高效脱氮不动杆菌新种及其应用，不动杆菌Acinetobacterguangzhouensis YZS-X1-1具有较好的脱氮能力，能够有效去除氨氮及亚硝酸盐氮，从而保护环境。

还有，中国专利200910213798.7一种同时脱硫、脱氮、脱色的废水生物处理方法，公开了一种同时脱硫、脱氮、脱色的废水生物处理方法。

还有，中国专利201210171297.9一株高盐生物脱氮的盐弧菌菌株及其在废水处理中的应用。

还有，中国专利申请201110288612.1海洋异养脱氮细菌的混养富集筛选方法。

业界亟待更多样化的具有污海水脱氮能力的弧菌，以解决污海水生物强化处理中存在的问题。

技术实现要素：

本发明所要解决的问题在于，提供一种具有污海水脱氮能力的弧菌及其用途，及应用该弧菌制备的净污菌剂，及该菌剂的制备方法。

本案目的之一是提供一种具有污海水脱氮能力的弧菌的菌剂制备方法。

一种具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的制备方法，该方法具有将菌株接种于培养基中，培养菌种的步骤，其中，菌株接种是将该弧菌试管种接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，培养温度为20℃-40℃、振荡速度为120-180转/分钟，摇瓶振荡培养至对数期；

所述的具有污海水脱氮能力的弧菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC No.12311。

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的制备方法，还有，将培养好的菌种接入到发酵罐培养基的步骤：将培养好的菌种，按培养基重量的0.5％-1％或1％-2％的接种量接入到预设容积的发酵罐中，发酵罐中有预设量的发酵罐培养基，培养至对数生长期。

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的制备方法，还有，发酵培养的步骤：菌种接入到发酵罐后，无菌空气的通气量为10-30升/分钟。

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的制备方法，搅拌速度为120转/分钟-200转/分钟，或/和，培养温度为25℃-40℃。

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的制备方法，全流程培养时间为24-48小时。

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的制备方法，发酵完成后培养液分装，或采用无菌附着物吸附、干燥，制成固体菌剂。

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的制备方法，其中，将菌株接种于培养基中，培养菌种的步骤，其中，所述的牛肉膏蛋白胨培养基具有：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，pH 7.0，余量为添加剂。

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的制备方法，其中，将培养好的菌种接入到发酵罐培养基的步骤：所述发酵罐培养基成分具有：Na₂HPO₄、KH₂PO₄、KNO₃、葡萄糖和海水；当海水量为1000毫升时，Na₂HPO₄为7.9克，KH₂PO₄为1.5克，KNO₃为1.0克，葡萄糖为9.4克，发酵罐培养基pH值为7.0-7.5。

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的制备方法，其中，将菌株接种于培养基中，培养菌种的步骤，其中，培养温度为20℃-25℃或26℃-30℃或31℃-35℃或36℃-37℃或38-40℃的任一范围值。

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的制备方法，其中，将菌株接种于培养基中，培养菌种的步骤，其中，振荡速度为120-150转/分钟或151-160转/分钟或161-170转/分钟或171-180转/分钟的任一范围值。

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的制备方法，其中，发酵培养的步骤：菌种接入到发酵罐后发酵培养，无菌空气通气量优选为10升/分钟或20升/分钟或30升/分钟的任一值；

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的制备方法，其中，搅拌速度优选为60-90转/分钟或91-120转/分钟的任一范围值；或/和，培养温度优选为25℃-30℃或31℃-35℃或36℃-40℃的任一范围值；

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的制备方法，其中，所述全流程培养时间优选为24-30小时或31-36小时或37-42小时或43-48小时任一范围值；

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的制备方法，其中，所述污海水脱氮净污菌，适合pH值在5.0-6.0或6.1-7.0或7.1-8.0或8.1-9.0任一范围值；

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的制备方法，其中，所述污海水脱氮菌菌株的适合碳源为葡萄糖或乙酸钠或丁二酸钠或草酸钠或柠檬酸钠任一种。

本案又一目的是提供一种具有污海水脱氮能力的弧菌的菌剂，可以用前述的方法制备。

前述方法制备的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂，其中，所述具有污海水脱氮能力的弧菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC No.12311。

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂，其中，所述具有污海水脱氮能力的弧菌，适合碳源为葡萄糖或乙酸钠或丁二酸钠或草酸钠或柠檬酸钠任一种；或/和，所述具有污海水脱氮能力的弧菌DNA的G+C含量为44.3mol％；所述“G+C含量”是指“DNA分子中鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)所占的摩尔百分比值”；或/和，适宜生长的温度为20℃-25℃或26℃-30℃或31℃-35℃或36℃-37℃或38-40℃的任一范围值；或/和，所述具有污海水脱氮能力的弧菌，适合pH值在5.0-6.0或6.1-7.0或7.1-8.0或8.1-9.0任一范围值。

本案又一目的是提供一种前述弧菌菌剂的用途。

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的用途，用于海水利用后的废水处理，所述海水利用后的废水为含有氮源污染物的海水养殖废水。

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的用途，用于海水利用后的废水处理，所述海水利用后的废水，其中的氮源污染物，以硝酸盐氮(NO₃^--N)计，初始浓度为150毫克/升。

本案又一目的是提供一种具有污海水脱氮能力的弧菌，本案又称污海水脱氮弧菌。

本发明具有污海水脱氮能力的弧菌采取以下技术方案来实现的：

一株具有污海水脱氮能力的弧菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC No.12311。

本案具有污海水脱氮能力的弧菌还可采用以下技术措施来进一步实现：

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌，其中，所述菌株16S rDNA序列为：

本案又一目的是提供一种前述弧菌用途。

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌的用途，其中，将该菌株制成的微生物制剂，用于海水利用后的废水处理，所述海水利用后的废水为含有氮源污染物的海水养殖废水。

前述的具有污海水脱氮能力的弧菌的用途，其中，将该菌株制成微生物制剂后用于海水利用后的废水处理，所述海水利用后的废水，其中的氮源污染物，以硝酸盐氮(NO₃^--N)计，初始浓度为150毫克/升。

由此，具有污海水脱氮能力的弧菌菌株制成的微生物净污菌剂用于海水养殖废水处理，处理时间仅24小时，污水脱氮净化效果就非常显著，而且菌剂具有可靠的生物安全性。

本发明与现有技术相比具有显著的优点和有益效果。由以上技术方案可知，本发明在优异的结构配置下，至少有如下的优点：

本案具有污海水脱氮能力的弧菌及其用途，本发明中的弧菌MCW153，不仅具有较好的脱氮能力，能够有效去除硝酸盐氮及亚硝酸盐氮，而且安全无害，生物安全性试验表明(菌体投喂金鱼3个月)，金鱼生长状况良好，且优于对照组。弧菌MCW153用于制作生物脱氮菌剂，对于解决海水水产养殖水体总氮超标等富营养化问题，具有良好的产业应用和市场前景。

本案污海水脱氮菌的成功分离可以解决海水养殖废水处理中长期困扰的难题，本案污海水脱氮菌分离方法简单，分离和培养方法也较容易推广，随着培养技术的发展，它可以利用许多有机物(包括鱼虾排泄物、饲料残渣等)作为其碳源，因此，本案污海水脱氮菌作为污海水高效净污微生物菌剂的生物材料，具有优异的产业推广和应用价值。

由本案具有污海水脱氮能力的弧菌制备的菌剂，可使菌剂的制造成本更低廉，更有益于产业推广应用；由本案的菌剂制备方法得到的菌剂特别能满足海水养殖废水的净化处理的实际问题和需求，使用本菌剂能够快速启动新建含盐污水处理设施的生物净化能力和恢复恶化的生物系统的强化脱氮处理能力。

本案一株具有污海水脱氮能力的弧菌MCW153具有良好的总氮去除效果，实验室摇瓶试验结果表明，人工模拟废水总氮去除率更高。

可见，本案所述弧菌制备成用于海水养殖废水治理的微生物制剂，针对目前常规污水处理技术不能有效地处理海水养殖废水(低碳高氮)的情况，采用本案的生物强化技术，通过向污水处理设施中投加本案弧菌的菌剂，可大大缩短污泥驯化时间、显著提高脱氮处理效果，可有效节省投资和运行成本，从而解决当前海水养殖废水生物处理中存在的脱氮效果差和污泥驯化时期过长等迫切需要解决的问题。

本发明对比现有技术有显著的贡献和进步，确实是具有新颖性、创造性、实用性的好技术。

附图说明

图1是本发明所述弧菌菌体透射电镜照片；

图2是本发明所述弧菌最适温度示意图；

图3是本发明所述弧菌最适转速示意图；

图4是本发明所述弧菌最适接种量示意图；

图5是本发明所述弧菌最适通气量示意图；

图6是本发明所述弧菌最佳发酵时间示意图；

图7是本发明所述弧菌最适pH值示意图；

图8是本发明所述弧菌最适碳源示意图；

图9是本发明所述菌剂对人工海水养殖废水的脱氮效果示意图；

图10是本案一株具有污海水脱氮能力的弧菌MCW153的生物安全性试验。

具体实施方式

本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。

以下结合较佳实施例，对依据本发明提供的具体实施方式、步骤、特征及其功效，详细说明如下。

实施例1

一种具有污海水脱氮能力的弧菌，本案也称污海水脱氮菌，或称：污海水脱氮弧菌，该弧菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC No.12311。

所述的具有污海水脱氮能力的弧菌DNA的G+C含量为44.3mol％。具有污海水脱氮能力的弧菌，革兰氏染色阴性(G^-)，细胞椭圆形，以极生鞭毛运动。具有污海水脱氮能力的弧菌，氧化酶、接触酶、硝酸盐的任一种还原反应均为阳性。具有污海水脱氮能力的弧菌菌株利用葡萄糖、乙酸钠、丁二酸钠等为碳源。具有污海水脱氮能力的弧菌菌株利用葡萄糖和其他(半乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖等)一些糖类产酸。污海水脱氮菌适宜的pH值在5-9之间，适宜生长温度为30-35℃。

本案一株具有污海水脱氮能力的弧菌MCW153具有良好的总氮去除效果，实验室摇瓶试验结果表明，人工模拟废水总氮去除率更高。

实施例2

实施例1所述具有污海水脱氮能力的弧菌的净污菌剂制备方法，包括以下工艺过程：

步骤1：将污海水脱氮菌试管种接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，培养温度为30℃、振荡速度为160转/分钟，摇瓶振荡培养至对数期；牛肉膏蛋白胨培养基为市售培养基。

步骤2：将上述培养好的菌种，按培养基重量0.5％-2％的接种量接入到发酵罐中，发酵罐中有培养基，发酵罐所用的培养基具有：Na₂HPO₄7.9克，KH₂PO₄1.5克，KNO₃1.0克，葡萄糖9.4克，海水1000毫升。

步骤3：发酵罐生产过程中，无菌空气的通气量为10-30升/分钟，搅拌速度为160转/分钟，培养温度为30℃，全流程培养时间为24小时，发酵完成后培养液分装，或采用无菌附着物吸附、干燥，制成固体菌剂。

由此可见，污海水脱氮菌分离方法简单，分离和培养也较容易，随着培养技术的发展，它可以利用许多有机物(包括鱼虾排泄物、饲料残渣等)作为其碳源。

由污海水脱氮菌制备菌剂，制造成本更低廉，更有益于产业推广应用。由此，污海水脱氮菌剂制备方法得到的菌剂特别能满足海水养殖废水的净化处理的实际问题和需求，使用本菌剂能够快速启动新建含盐污水处理设施的生物净化能力和恢复恶化的生物系统的强化脱氮处理能力。

实施例3

一种具有污海水脱氮能力的弧菌的用途，为弧菌菌株制成的微生物净污菌剂用于海水养殖废水处理，处理时间为24小时，污水脱氮净化效果显著。

实施例4

参见附图1至图10所示，本案涉及组分引用重量百分比，下不赘述。

一株具有污海水脱氮能力的弧菌MCW153，该生物材料保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC No.12311，保藏时间2016年3月25日，存活，见保藏证明；图1是菌株MCW153透射电镜照片；

在本案，具有污海水脱氮能力的弧菌MCW153又称污海水脱氮菌，具体描述如下：

该污海水脱氮菌经鉴定为弧菌属(Vibrio sp.MCW153)，主要生物学特性为革兰氏阴性(G^-)，细胞为椭圆形，有鞭毛，菌体大小0.8×1.2微米；在已有的LB培养基平板上培养3天的菌落为米色、扁平圆形、表面轻度颗粒状湿润、边缘轻微褶皱，直径在2.5毫米左右。

所述污海水脱氮净污菌，氧化酶、接触酶、硝酸盐的任一种还原反应均为阳性；其脲酶试验、吲哚反应均为阴性；利用葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、麦芽糖等一些糖类产酸。参见污海水脱氮净污菌MCW153生理生化特征表。所述污海水脱氮净污菌适宜的pH值在5-9之间，优选适宜生长温度为30℃。所述污海水脱氮净污菌DNA的G+C含量为44.3mol％；其中，“G+C含量”是通常指的“DNA分子中鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)所占的摩尔百分比值”。

污海水脱氮菌MCW153生理生化特征

该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为KU644134。

对分离得到的菌株16S rDNA序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，聚合酶链式反应(PCR)产物送上海生工测序，基序列如下：

污海水脱氮弧菌的菌株16S rDNA序列为：

NCBI序列分析结果表明，MCW153菌株的16S rDNA序列与Vibrio sp.(弧菌)多个菌株的序列同源性在99％以上。

具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂的制备方法，包括以下工艺过程：

步骤1：将具有污海水脱氮能力的弧菌试管种接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，培养温度为25℃-40℃、振荡速度为120-180转/分钟，摇瓶振荡培养至对数期；牛肉膏蛋白胨培养基可以是一般市售品。

步骤1进一步的实施例是：

优选的牛肉膏蛋白胨培养基具有：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，pH 7.0，余量为惯常的添加剂不予赘述；

所述具有污海水脱氮能力的弧菌为前述的保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌种，参见图1，保藏编号为CGMCC No.12311；

所述具有污海水脱氮能力的弧菌试管种接种于牛肉膏蛋白胨培养基中的培养温度优选为20℃-25℃或26℃-30℃或31℃-35℃或36℃-37℃或38-40℃的任一范围值；

参见图2，试验表明，在温度为20℃～40℃时，菌株都能生长良好，且在温度为30℃时，生物量达到最大。

所述的具有污海水脱氮能力的弧菌试管种接种于牛肉膏蛋白胨培养基中的摇瓶振荡的速度优选为120-150转/分钟或151-160转/分钟或161-170转/分钟或171-180转/分钟的任一范围值，搅拌速度转/分钟也表示为r/min；

参见图3，试验表明摇床转速对菌株生长的影响，摇瓶振荡的速度过低不利于菌株MCW153的生长，随着转速加快，细胞生物量增多，但过高的转速容易使培养液溢出，因此，适宜的菌株培养转速为120-180转/分钟，最佳的转速为160转/分钟。

步骤2：将上述培养好的菌种，按培养基重量的0.5％-2％的接种量接入到预设容积的发酵罐中，发酵罐中有预设量的培养基，如将上述培养好的菌种，按1％的接种量接入到预设容积量的发酵罐中，如10升发酵罐，培养至对数生长期；

步骤2进一步的实施例是：

优选的发酵罐所用的培养基具有：Na₂HPO₄7.9克，KH₂PO₄1.5克，KNO₃1.0克，葡萄糖9.4克，pH 7.0-7.5，海水1000毫升；

所述污海水脱氮净污菌的接种量与培养基的重量百分比优选为1％-1.5％或1.5％-2％的任一范围值。

参见图4，此试验表明了具有污海水脱氮能力的弧菌的接种量对制备菌剂的影响。当培养24小时后，随着接种量增加，菌剂生长量变化不大，因此，菌剂发酵的适宜接种量在1-2％均可，但结合成本因素，选择1％接种量可有效降低成本；

步骤3：发酵罐生产过程中，无菌空气的通气量为10-30升/分钟，搅拌速度为120转/分钟-200转/分钟，培养温度为25℃-40℃，全流程培养时间为24-48小时，发酵完成后培养液分装，或采用无菌附着物吸附、干燥，制成固体菌剂。

通气量升/分钟也表示为L/min。

步骤3进一步的实施例是：

所述无菌空气通气量优选为10升/分钟或20升/分钟或30升/分钟的任一范围值；

参见图5，试验表明通气量对菌种发酵的影响较大，其中，通气量为10-30升/分钟时，菌剂生长良好。

搅拌速度优选为60-90转/分钟或90-120转/分钟的任一范围值；

培养温度优选为25℃-30℃或31℃-35℃或36℃-40℃的任一范围值；

所述全流程培养时间优选为24-30小时或30-36小时或36-42小时或42-48小时任一范围值；小时也表示为h。

参见图6，试验表明，随着发酵培养时间的增加，菌体不断生长，其中，发酵时间为4-16小时，菌剂处于最佳的生长状态。

所述发酵罐用的培养基包括：Na₂HPO₄(磷酸氢二钠)7.9克，KH₂PO₄(磷酸二氢钾)1.5克，KNO₃(硝酸钾)1.0克，葡萄糖9.4克，pH 7.0-7.5，海水1000毫升；

所述具有污海水脱氮能力的弧菌，适合pH值优选在5.0-6.0或6.1-7.0或7.1-8.0或8.1-9.0任一范围值。

所述具有污海水脱氮能力的弧菌，最适pH值优选在6或7或8或9的任一值；

参见图7，试验表明菌株MCW153适应pH值范围较广，在初始pH值5.0-9.0范围均能内能良好生长。

参见图8，试验表明碳源(葡萄糖、乙酸钠、丁二酸钠、草酸钠、柠檬酸钠等)对菌剂发酵有较大的影响，其中，葡萄糖为碳源时的硝酸盐氮去除效果最佳，因此，葡萄糖为菌株MCW153的最适碳源。

发酵完成后还可以：培养液直接用塑料包装桶分装，或采用活性炭吸附制成固体菌剂。

由前述方法制得菌剂具有可靠的生物安全性。

参见图10，生物安全性试验(菌体投喂金鱼)表明，弧菌MCW153菌株，安全无害，菌体投喂金鱼3个月，金鱼生长状况良好，且优于对照组。

由前述方法制得菌剂用于海水养殖废水的处理，污水脱氮净化效果显著。

由前述各实施例制得的具有污海水脱氮能力的弧菌菌剂应用于海水养殖废水的处理，而且不断进一步的菌剂制备措施配置，可使菌剂的制造成本更低廉，更有益于产业推广应用，有下述试验可说明本案污海水脱氮净污菌剂处理海水养殖废水的优异效果。

实验室摇瓶试验，参见图9：

把MCW153菌株接种于硝酸盐氮(NO₃^--N)初始浓度为150毫克/升的人工海水养殖废水中，30℃、160转/分钟摇床培养，定时取样测定菌体生长、硝酸盐氮(NO₃^--N)和亚硝酸盐氮(NO₂^--N)的浓度情况。

图9的结果表明，MCW153能在12小时内将硝酸盐氮(NO₃^--N)浓度从150毫克/升以上降至0.05毫克/升以下，同时，亚硝酸盐氮(NO₂^--N)的浓度先逐步升高，然后逐步降低至0.05毫克/升以下，说明MCW153菌株具有高效的反硝化脱氮能力，对人工海水养殖废水具有较好的脱氮净化效果。

另外，由图9还表明，MCW153菌株的生长同步于硝酸盐氮(NO₃^--N)浓度的降低，且MCW153菌株的生长曲线、亚硝酸盐氮(NO₂^--N)的代谢曲线中的迟缓期基本都在0-3小时，然后进入对数期(4-15小时)，约在24小时达到最高的菌体生长量。浓度单位“毫克/升”也表示为“mg/L”。海水利用后的废水为含有氮源污染物的海水养殖废水。

本案具有污海水脱氮能力的弧菌及其用途，本发明中的弧菌MCW153，不仅具有较好的脱氮能力，能够有效去除硝酸盐氮及亚硝酸盐氮，而且安全无害，生物安全性试验表明(菌体投喂金鱼3个月)，金鱼生长状况良好，且优于对照组。弧菌MCW153进一步可以用于制作生物脱氮菌剂，尤其对于解决海水水产养殖水体总氮超标等富营养化问题，具有良好的应用前景。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。