本发明涉及环境微生物技术领域，具体的说是一种从海水养殖废水沉积物中筛选具有硝化功能的细菌的方法。
背景技术：
近几十年来，我国的海水养殖产量呈逐年递增态势，水产养殖已经成为我国农业的支柱性产业之一。最近30年里，水产养殖业在全球动物性食品生产中增长最快，而中国对水产养殖产品的生产贡献率最大，最近几年，中国水产品养殖产量约占世界水产品养殖产量的2/3。而我国传统的水产养殖业已由小范围、分散经营向规模化、集约化方向发展。
水产养殖过程中，水体的氨、硝酸盐、亚硝酸盐等营养元素含量过高所造成的富营养化情况频繁出现。除了会改变水质与生物平衡外，其中氨态氮和亚硝酸盐氮等毒性较高会对水生动物造成严重影响。养殖水体中氨氮和亚硝酸盐氮的去除方法主要有物理法、化学法和微生物法等，其中微生物法是一种较理想的方法，由微生物引起的硝化作用是水中氮素释放的重要机制之一。
硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养细菌，包括亚硝化菌和硝化菌两个生理菌群。其主要特性是亚硝化细菌和硝化细菌都是绝对好气的自养菌，由于其好氧性、依附性和产酸性，喜欢生长在碱性的土壤中，它们不能在一般含有机质的培养基中生长，生长速率低。由于硝化细菌的上述特点，在一般的污水处理系统中硝化细菌的含量较低。而硝化细菌是生物硝化中起主要作用的微生物,污水中硝化细菌的含量与硝化速度成正比关系。
对于硝化细菌培养方面的研究，国外已有此类技术专利，其中一些已经形成工业化生产，但产品价格较昂贵，并且必须经常性向反应器中投加，以补充流失的硝化细菌量，并抑制其它菌种的生长。法国学者采用留有微生物的简易发酵罐来培养硝化细菌，认为在合适的条件下硝化细菌经过5个星期的连续纯培养,其含量可达2.7×109个mL-1。Hung Yuanfang等人提出的通过投加葡萄糖和酵母膏等营养物，促进硝化菌和亚硝化菌的生长，可使焦化废水中90％的氨氮在7～14d内转化为亚硝态或硝态氮，当硝化细菌增加到一定数量后，不需再投加营养物即可维持一定的硝化速率。
目前已知的硝化细菌大多是从淡水环境中分离得来，能用于海水养殖中水处理的报道较少。本研究从海水养殖废水沉积物中进行硝化细菌的筛选和分离，从而为海水养殖废水无机氮污染的生物修复提供菌种储备和理论支持。
本发明引用下述参考文献，所有文献内容在此全部引入并作参考：
[1]刘海洋,戴志军.中国近海污染现状分析及对策[J].环境保护科学,2001,27(4):6-8.
[2]全为民,沈新强.长江口及邻近水域渔业环境质量的现状及变化趋势分析[J].海洋渔业,2004(2):524-534.
[3]闫海，林毅雄，孙建新.海水微生物菌群去除氨氮和亚硝酸氮研究[J].环境污染治理技术与设备,2003,11(4):44-47.
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所述具有硝化功能的细菌属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，命名为nitrification-HN07菌株，于2016年6月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO.60043。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具有硝化功能的及构建方法。
优选地，本发明所述细菌是从海水养殖废水沉积物中筛选的。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种具有硝化功能的细菌，其特征在于：所述硝化细菌为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，命名为nitrification-HN07菌株，于2016年6月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO.60043。
所述硝化细菌如序列编号所示。
所述硝化细菌的构建方法，其包括下述步骤：
1)富集培养；
2)分离纯化；
3)菌种保存；
4)菌种鉴定。
优选地，所述富集培养步骤包括：取样品分别接种于亚硝化细菌培养基和硝化细菌培养基中，在26℃、160r/min下恒温振荡培养2天，将培养液接种至新的培养基，重复此操作3次，共培养8天，待用。
优选地，所述分离纯化步骤包括取已富集的细菌培养液分别划线至亚硝化细菌和硝化细菌固体培养基，于30℃下恒温生化培养箱中培养，3-4d后挑取单菌落划线至新的平板，重复操作5次，分别分离出长势较好的10株单菌落。
优选地，所述菌种保存步骤包括分别配制亚硝化细菌和硝化细菌固体斜面培养基，将上述长势较好的10株单菌落划线至斜面培养基，于培养箱中培养3d后，放置4℃冰箱保存。
优选地，所述菌种鉴定步骤包括分别将上述获得的亚硝化细菌和硝化细菌的纯菌落进行鉴定，选出好氧硝化性能优异的亚硝化细菌和硝化细菌，再对此细菌进行16S rDNA鉴定，即筛选出好氧硝化细菌菌株；
所述16S rDNA鉴定方法，包括PCR扩增程序，该程序是94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min，根据NCBI及参考文献设计引物：
上游引物F：(5'-CGGAATTCATGATGTCGCCCAATGGCTC-3')
下游引物R：(5'-CCCAAGCTTTCAGGCGGCCGCCTTGCCGC-3')。
优选地，所述培养基为：
亚硝化细菌培养基成分为：每升培养基由NH4Cl4 0.4g，K2HPO4·3H2O 8.0g，KH2PO41.5g，CH3COONa 4.4g，MgSO4·7H2O 0.1g，微量元素溶液1mL，PH为7.0-7.3；其中，微量元素：ZnSO4 2.2g，CaCl2·2H2O 5.5g，FeSO4·7H2O 5.0g，CuSO4·5H2O 1.57g，CoCl2·6H2O 1.61g，MnCl2·4H2O 5.0g，Na2MoO4·4H2O 1.1g，Na2EDTA 63.7g，去离子水1000mL组成；pH 7.0，于121℃下灭菌20min备用；
硝化细菌培养基成分为：每升培养基由NaNO2 1.0g，NaCO31.0g,CaCO3 1.0g，K2HPO4·3H2O 8.0g，MgSO4·7H2O 0.1g，微量元素溶液1mL，PH为7.0-7.3；其中，微量元素：ZnSO4 2.2g，CaCl2·2H2O 5.5g，FeSO4·7H2O 5.0g，CuSO4·5H2O 1.57g，CoCl2·6H2O 1.61g，MnCl2·4H2O 5.0g，Na2MoO4·4H2O 1.1g，Na2EDTA 63.7g，去离子水1000mL组成；pH 7.0，于121℃下灭菌20min备用。
优选地，所述亚硝化细菌和硝化细菌的鉴定方法为：
亚硝化细菌鉴定：取10株亚硝化细菌单菌落接种于亚硝化细菌培养基，另取一份亚硝化细菌培养基接种1.0ml无菌水作为对照，于26℃振荡器中培养48h，取上述10株菌株培养液以及对照液于白瓷比色板上，加格里斯试剂甲液和乙液各一滴，若有亚硝化存在则呈红色；
硝化细菌鉴定：取10株硝化细菌单菌落接种于硝化细菌培养基，另取一份硝化细菌培养基接种1.0mL无菌水作为对照，于26℃振荡器中培养48h。分别取上述硝化细菌培养液10mL于试管中，首先为了去除培养液中的NO-，在培养液中加入醋酸5-8滴使之酸化，再加入数粒对氨基苯磺酸，当停止放气时，再加入一粒对氨基苯磺酸，此过程中NO-转化为氮气逸出，分别取此培养液以及对照液于白瓷比色板上，逐滴加入加格里斯试剂，如不呈现红色，证明亚硝化已完全消失，再加二苯胺试剂2-4滴，如呈现蓝色说明有硝化细菌的存在。
优选地，所述格里斯试剂为A液和B液，A液为对氨基苯磺酸0.5g、稀醋酸150mL；B液为α—萘胺0.1g、蒸馏水20mL、稀醋酸150mL。所述二苯胺试剂为：A液：1.5克二苯胺(C12H11N)溶于100mL冰醋酸(乙酸,C2H4O2)中，再加1.5mL浓硫酸，用棕色瓶保存，如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化，再使用；B液：体积分数为0.2％的乙醛溶液(C2H4O)，将0.1mL B液加入10mL A液中，即为二苯胺试剂，现配现用。
更优选地，本发明还提供了一种从海水养殖废水沉积物中筛选具有硝化功能的细菌的方法：
1)富集培养：取样品分别接种于亚硝化细菌培养基和硝化细菌培养基中，在26℃、160r/min下恒温振荡培养2天，将培养液接种至新的培养基，重复此操作3次，共培养8天，待用；
2)分离纯化：取上述已富集的细菌培养液分别划线至亚硝化细菌和硝化细菌固体培养基，于30℃下恒温生化培养箱中培养，3-4d后挑取单菌落划线至新的平板，重复操作5次，分别分离出长势较好的10株单菌落；
3)菌种保存：分别配制亚硝化细菌和硝化细菌固体斜面培养基，将上述长势较好的10株单菌落划线至斜面培养基，于培养箱中培养3d后，放置4℃冰箱保存；
4)菌种鉴定：分别将上述获得的亚硝化细菌和硝化细菌的纯菌落进行鉴定，选出好氧硝化性能优异的亚硝化细菌和硝化细菌，再对此细菌进行16S rDNA鉴定，即筛选出好氧硝化细菌菌株。
所述培养基为：
亚硝化细菌培养基成分为：每升培养基由NH4Cl4 0.4g，K2HPO4·3H2O 8.0g，KH2PO41.5g，CH3COONa 4.4g，MgSO4·7H2O 0.1g，微量元素溶液1mL，PH为7.0-7.3。其中，微量元素：ZnSO4 2.2g，CaCl2·2H2O 5.5g，FeSO4·7H2O 5.0g，CuSO4·5H2O 1.57g，CoCl2·6H2O 1.61g，MnCl2·4H2O 5.0g，Na2MoO4·4H2O 1.1g，Na2EDTA 63.7g，去离子水1000mL组成。pH 7.0，于121℃下灭菌20min备用。
硝化细菌培养基成分为：每升培养基由NaNO2 1.0g，NaCO3 1.0g，CaCO31.0g，K2HPO4·3H2O 8.0g，MgSO4·7H2O 0.1g，微量元素溶液1mL，pH为7.0-7.3。其中，微量元素：ZnSO4 2.2g，CaCl2·2H2O 5.5g，FeSO4·7H2O 5.0g，CuSO4·5H2O 1.57g，CoCl2·6H2O 1.61g，MnCl2·4H2O 5.0g，Na2MoO4·4H2O 1.1g，Na2EDTA 63.7g，去离子水1000mL组成。pH 7.0，于121℃下灭菌20min备用。
所述亚硝化细菌和硝化细菌鉴定方法为：
亚硝化细菌鉴定：取上述10株亚硝化细菌单菌落接种于亚硝化细菌培养基，另取一份亚硝化细菌培养基接种1.0mL无菌水作为对照。于26℃振荡器中培养48h。取上述10株菌株培养液以及对照液于白瓷比色板上，加格里斯试剂甲液和乙液各一滴，若有亚硝化存在则呈红色，实验结果表明，7号菌株培养液均呈现红色，而其他菌株及对照并没有显色。因此，7号菌株均有氨氧化作用，即硝化活性，即7号菌株为具有亚硝化功能的细菌。
硝化细菌鉴定：取上述10株硝化细菌单菌落接种于硝化细菌培养基，另取一份硝化细菌培养基接种1.0mL无菌水作为对照。于26℃振荡器中培养48h。分别取上述硝化细菌培养液10mL于试管中，首先为了去除培养液中的NO-，在培养液中加入醋酸5-8滴使之酸化，再加入数粒对氨基苯磺酸，当停止放气时，再加入一粒对氨基苯磺酸，此过程中NO-转化为氮气逸出。分别取此培养液以及对照液于白瓷比色板上，逐滴加入加格里斯试剂，如不呈现红色，证明亚硝化已完全消失。再加二苯胺试剂2-4滴，如呈现蓝色说明有硝化细菌的存在。实验结果表明，均未出现蓝色，证明不存在将亚硝酸氧化成硝酸的菌株，即不存在硝化细菌。
所述格里斯试剂为A液和B液，A液为对氨基苯磺酸0.5g、稀醋酸150mL；B液为α—萘胺0.1g、蒸馏水20mL、稀醋酸150mL。
所述二苯胺试剂为：A液：1.5克二苯胺(C12H11N)溶于100mL冰醋酸(乙酸,C2H4O2)中，再加1.5mL浓硫酸，用棕色瓶保存(光下分解)。如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用；B液：体积分数为0.2％的乙醛溶液(C2H4O)。将0.1mL B液加入10mL A液中，即为二苯胺试剂，现配现用。
所述16S rDNA鉴定方法，其特征在于PCR扩增程序，该程序是94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。根据NCBI及参考文献设计引物：
上游引物F：(5'-CGGAATTCATGATGTCGCCCAATGGCTC-3')
下游引物R：(5'-CCCAAGCTTTCAGGCGGCCGCCTTGCCGC-3')
将编号为7号的细菌的PCR产物送至华大基因做测序，所测的序列长度在1000bp左右，经NCBI的BLAST对比为硝化细菌，其序列如下：
GCGGCACATAGAACAGCATCGGCAGCGTGCGGAACTCCGGATGCAACGGCAGCGCGATGCCCCATTTCTTCACGAACTGG
AAAACCGGGAGACTTCTGCGCAGCCTCGATCTTCGCATCTGGAATCCCGTTCGCCCTCGCGGCGGCGATGATCTCCGGAT
CAAACGGATCCTTGATGATGTTGCGCTGAGCCATCACCAGCTGGTCTGCGGCGACTTCGCGGTCTCCTCGATCGCATCCG
CATCGTAAAGCACGAGGCCGATATACCGGATGCGTCCGACGCAGGAGTGGAAGCACGCCGGCGGCTGGCCGCTCTCCAGA
CGCGGATAGCACAGGATGCACTTCTCGGCCTTGCCGGTCGACCAGTTGAAGTAGGTCTTCTTGTAGGGGCAGCCGGAAAC
GCACATGCGCCAGGCGCGGCAGCGTTCCTGGCTCACCAGCACAACGCCGTCCTCACCGCGCTTGTAGAGCGCGCCCTGCG
GACACGCCGCAACGCATCCCGGATTGAGGCAATGGTTGCAGATGCGCGGCAGATAGAAAAACACCGTGCTGTTGATCTCG
TTGATCTGGCGCATCTCCTCGTCGGAAGCGCCGTCGAAGTTCGGGTCGTTGTTGGCGTAAACCTGCGAACCGCCGAGGTC
GTCGTCCCAGTTCGGACCCGCCTCGATCGTGTCCATGTACTTGCCGGTCACCATCGAGATCGCCCGCGCAGTCGGCTGCT
CGTCGGCCAGCGGCGCATTGATCAGGTTCTGGTAGTCGTAGGTCCAGGGCTCGAAATAATCGTCGAGCGTCGGCAGATAG
GGGTTGTAGAAAATGTTCGTCAGCGTGCCCCACTTGCCCTGCAGCCGCAGCCGCAGGCTCTTCTGCCGCTGACCGTCAAC
CACCCAGCCGCCACGATACTTGGTCTGGTCTTCCCAACGTGTCGGGTAACCCGTACCCGGCTTGGTCTCCACGTTGTTCC
AGTACATGTACTCGGTGCCCTTGCGATCGGTCCAGATGTTCTTGCACGCGATGCTGCAGGTGTGGCAACCGAT
本发明所具有的优点：
1、采用本发明可从海水养殖废水沉积物中分离筛选一种耐盐具有硝化功能的细菌，具有简便、快速、重复性好、分离菌株效果好、准确可靠等特点。
2、采用本发明筛选出来的耐盐硝化具有硝化功能的细菌可用于海水养殖废水无机氮污染的生物修复。
实施例
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
样品采集自海南某石斑鱼高位养殖池池底(具体位置为：海南省文昌市会文镇冯家村正盛养殖场)。
使用的主要仪器和设备有：
电子天平(CP124C)，奥豪斯(上海)仪器有限公司；
电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9140A)，上海飞越实验仪器有限公司；
立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-50KBS)，上海申安医疗器械厂；
水浴恒温振荡器(HZS-H),常州普天仪器制造有限公司；
生物洁净工作台(BCM-1000A)，苏州安泰空气技术有限公司；
电热恒温水槽(HH-W600)，上海浦东物理光学仪器厂；
光学显微镜，motic麦克奥迪实业集团有限公司；
伯乐梯度PCR仪-S1000，Bio-Rad；
Dragon 5mL、1mL、200uL、200uL、5uL移液枪。
实验过程：
1)富集培养：称取两份40g沉积物样品，在无菌操作台上分别接种于事先已灭菌，内装有玻璃珠的200mL亚硝化细菌培养基和硝化细菌培养基的三角瓶中，置于水浴恒温振荡器内以26℃、160r/min下恒温振荡培养2天，目的是打散菌胶团，使细菌成单细胞状态分散于水中。于无菌操作台上分别将培养液接种至新的培养基，接种量为5％。重复此操作3次，共培养8天，待用；
所述培养基为：
亚硝化细菌培养基成分为：每升培养基由NH4Cl4 0.4g，K2HPO4·3H2O 8.0g，KH2PO41.5g，CH3COONa 4.4g，MgSO4·7H2O 0.1g，微量元素溶液1mL，pH为7.0-7.3。其中，微量元素：ZnSO4 2.2g，CaCl2·2H2O 5.5g，FeSO4·7H2O 5.0g，CuSO4·5H2O 1.57g，CoCl2·6H2O 1.61g，MnCl2·4H2O 5.0g，Na2MoO4·4H2O 1.1g，Na2EDTA 63.7g，去离子水1000mL组成。PH7.0，于115℃下灭菌20min备用。
硝化细菌培养基成分为：每升培养基由NaNO2 1.0g，NaCO3 1.0g，CaCO3 1.0g，K2HPO4·3H2O 8.0g，MgSO4·7H2O 0.1g，微量元素溶液1mL，pH为7.0-7.3。其中，微量元素：ZnSO4 2.2g，CaCl2·2H2O 5.5g，FeSO4·7H2O 5.0g，CuSO4·5H2O 1.57g，CoCl2·6H2O 1.61g，MnCl2·4H2O 5.0g，Na2MoO4·4H2O 1.1g，Na2EDTA 63.7g，去离子水1000mL组成。pH7.0，于115℃下灭菌20min备用。
2)分离纯化：取上述已富集的细菌培养液分别划线至亚硝化细菌培养基和硝化细菌固体培养基。首先用接种环挑取细菌培养液，然后在事先制好的平板上划线(注意不要划破琼脂表面)。划线时要在所划的范围内尽量划满，然后将接种环灼烧，再转动一定的角度连接已划线的区域再划另一区，最后划满整个平皿，于30℃下恒温生化培养箱中培养，3-4d后挑取单菌落划线至新的平板，重复操作5次，分离出长势较好的单菌落；
3)菌种保存：分别配制亚硝化细菌和硝化细菌固体斜面培养基，首先将已配好的液体培养基分装入20mL试管中，每支试管装入1/3容量的培养基。分装完毕后，需要用棉塞堵住瓶口，堵棉塞的主要目的是过滤空气，避免污染。塞好棉塞后灭菌备用。分别将上述长势较好的10株亚硝化细菌和硝化细菌单菌落划线至斜面培养基，首先用接种环挑取细菌培养液，然后将接种环伸进斜面培养基试管，在培养基上轻轻划线，接种菌体于其上。划线时要由底部起划较密的平行线，一直划到顶部，以充分利用斜面面积。于30℃下恒温生化培养箱中培养3d后，放置4℃冰箱保存；
4)菌种鉴定：将上述获得的纯菌落进行亚硝化细菌和硝化细菌鉴定，选出好氧硝化性能优异的菌株。再对此细菌进行16S rDNA鉴定，即筛选出好氧硝化细菌菌株。
亚硝化细菌鉴定：取上述10株亚硝化细菌单菌落接种于亚硝化细菌培养基，另取一份亚硝化细菌培养基接种无菌水作为对照。于26℃恒温振荡器中培养48h。取上述10株菌株培养液以及对照液于白瓷比色板上，加格里斯试剂甲液和乙液各一滴，若有亚硝化存在则呈红色，实验结果表明，7号菌株培养液均呈现红色，而其他菌株及对照并没有显色。因此，7号菌株有氨氧化作用，即硝化活性。即7号菌株为亚硝化细菌。
硝化细菌鉴定：取上述10株硝化细菌单菌落接种于硝化细菌培养基，另取一份硝化细菌培养基接种1.0mL无菌水作为对照。于26℃恒温振荡器中培养48h。分别取上述硝化细菌培养液10mL于试管中，首先为了去除培养液中的NO-，在培养液中加入醋酸5-8滴使之酸化，再加入数粒对氨基苯磺酸，当停止放气时，再加入一粒对氨基苯磺酸，此过程中NO-转化为氮气逸出。分别取此培养液以及对照液于白瓷比色板上，逐滴加入加格里斯试剂，如不呈现红色，证明亚硝化已完全消失。再加二苯胺试剂2-4滴，如呈现蓝色说明有硝化细菌的存在。实验结果表明，均未出现蓝色，证明不存在将亚硝化氧化成硝化的菌株。即不存在硝化细菌。
16S rDNA鉴定：其特征在于PCR扩增程序，该程序是94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。根据NCBI及参考文献设计引物如下：
上游引物F：(5'-CGGAATTCATGATGTCGCCCAATGGCTC-3')；
下游引物R：(5'-CCCAAGCTTTCAGGCGGCCGCCTTGCCGC-3')。
将编号为7号的细菌的PCR产物送至华大基因做测序，所测的序列长度在1000bp左右，经NCBI的BLAST对比为硝化细菌，经测试该细菌具有硝化功能。