一种具有硝化功能的细菌筛选及其构建方法与流程

技术特征：

1.一种具有硝化功能的细菌，其特征在于：所述具有硝化功能的为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，命名为nitrification-HN07菌株，于2016年6月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC NO.60043。

2.根据权利要求1所述的该细菌，其特征在于：其如序列编号1-5所示。

3.权利要求1或2所述该细菌的构建方法，其特征在于包括下述步骤：

1)富集培养；

2)分离纯化；

3)菌种保存；

4)菌种鉴定。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述富集培养步骤包括：取样品分别接种于亚硝化细菌培养基和硝化细菌培养基中，在26℃、160r/min下恒温振荡培养2天，将培养液接种至新的培养基，重复此操作3次，共培养8天，待用。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述分离纯化步骤包括取已富集的细菌培养液分别划线至亚硝化细菌和硝化细菌固体培养基，于30℃下恒温生化培养箱中培养，3-4d后挑取单菌落划线至新的平板，重复操作5次，分别分离出长势较好的10株单菌落。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述菌种保存步骤包括分别配制亚硝化细菌和硝化细菌固体斜面培养基，将上述长势较好的10株单菌落划线至斜面培养基，于培养箱中培养3d后，放置4℃冰箱保存。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述菌种鉴定步骤包括分别将上述获得的亚硝化细菌和硝化细菌的纯菌落进行鉴定，选出好氧硝化性能优异的亚硝化细菌和硝化细菌，再对此细菌进行16S rDNA鉴定，即筛选出好氧硝化细菌菌株；

所述16S rDNA鉴定方法，包括PCR扩增程序，该程序是94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min，根据NCBI及参考文献设计引物：

上游引物F：(5'-CGGAATTCATGATGTCGCCCAATGGCTC-3')

下游引物R：(5'-CCCAAGCTTTCAGGCGGCCGCCTTGCCGC-3')。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述培养基为：

亚硝化细菌培养基成分为：每升培养基由NH₄Cl₄ 0.4g，K₂HPO₄·3H₂O 8.0g，KH₂PO₄1.5g，CH₃COONa 4.4g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，微量元素溶液1mL，pH为7.0-7.3；其中，微量元素：ZnSO₄ 2.2g，CaCl₂·2H₂O 5.5g，FeSO₄·7H₂O 5.0g，CuSO₄·5H₂O 1.57g，CoCl₂·6H₂O 1.61g，MnCl₂·4H₂O 5.0g，Na₂MoO₄·4H₂O 1.1g，Na₂EDTA63.7g，去离子水1000mL组成；pH 7.0，于115℃下灭菌20min备用；

硝化细菌培养基成分为：每升培养基由NaNO₂ 1.0g，NaCO₃ 1.0g，CaCO₃ 1.0g，K₂HPO₄·3H₂O 8.0g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，微量元素溶液1mL，PH为7.0-7.3；其中，微量元素：ZnSO₄2.2g，CaCl₂·2H₂O 5.5g，FeSO₄·7H₂O 5.0g，CuSO₄·5H₂O 1.57g，CoCl₂·6H₂O 1.61g，MnCl₂·4H₂O 5.0g，Na₂MoO₄·4H₂O 1.1g，Na₂EDTA 63.7g，去离子水1000mL组成；pH 7.0，于115℃下灭菌20min备用。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述亚硝化细菌和硝化细菌的鉴定方法为：

亚硝化细菌鉴定：取10株亚硝化细菌单菌落接种于亚硝化细菌培养基，另取一份亚硝化细菌培养基接种1.0ml无菌水作为对照，于26℃振荡器中培养48h，取上述10株菌株培养液以及对照液于白瓷比色板上，加格里斯试剂甲液和乙液各一滴，若有亚硝化存在则呈红色；

硝化细菌鉴定：取10株硝化细菌单菌落接种于硝化细菌培养基，另取一份硝化细菌培养基接种1.0mL无菌水作为对照，于26℃振荡器中培养48h。分别取上述硝化细菌培养液10mL于试管中，首先为了去除培养液中的NO^-，在培养液中加入醋酸5-8滴使之酸化，再加入数粒对氨基苯磺酸，当停止放气时，再加入一粒对氨基苯磺酸，此过程中NO^-转化为氮气逸出，分别取此培养液以及对照液于白瓷比色板上，逐滴加入加格里斯试剂，如不呈现红色，证明亚硝化已完全消失，再加二苯胺试剂2-4滴，如呈现蓝色说明有硝化细菌的存在。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述格里斯试剂为A液和B液，A液为对氨基苯磺酸0.5g、稀醋酸150mL；B液为α—萘胺0.1g、蒸馏水20mL、稀醋酸150mL。所述二苯胺试剂为：A液：1.5克二苯胺(C₁₂H₁₁N)溶于100mL冰醋酸(乙酸,C₂H₄O₂)中，再加1.5mL浓硫酸，用棕色瓶保存，如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化，再使用；B液：体积分数为0.2％的乙醛溶液(C₂H₄O)，将0.1mL B液加入10mL A液中，即为二苯胺试剂，现配现用。