一种与桥本甲状腺炎辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，涉及一种与桥本甲状腺炎辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用。

背景技术：

桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis，HT)，也叫慢性淋巴细胞性甲状腺炎，是一种器官特异性自身免疫性疾病，可能会导致腺体肿大，甚至临床或亚临床的甲状腺功能减低。最近的证据表明，遗传易感性和环境因素是导致桥本氏甲状腺炎的主要因素，但是其具体发病机制仍不清楚。早期诊断和干预可能有助于防止HT和甲状腺功能异常的发展。目前HT的诊断主要是建立在侵入性的细针穿刺活检上的。血清中的自身抗体(ATAS)以及超声检查现在可用于诊断HT，但缺乏特异性。大多数HT患者早期无明显症状，因此容易导致漏诊和误诊。因此，目前需要寻找更多的生物标记物来协助早期、准确诊断HT。

微小RNA(Micro ribonucleic acids，miRNAs)的发现是最近这些年来重大发现之一。成熟的miRNA是一类进化保守，长度在18-25个核苷酸的小非编码RNA分子。据研究，miRNA可在转录后水平调控机体1/3以上的基因，从而参与机体的众多生理病理过程。miRNA的表达具有时间特异性以及组织特异性。同时，一些miRNA能够参与特定的生理病理以及特异的疾病过程。因此，某些特异的miRNA可以作为某些生理病理以及某些疾病例如肿瘤等疾病的标志物。2008年，Mitchell在外周血中检测到游离的miRNA，发现其能够稳定存在于外周血，并且能够作为诊断肿瘤的无创标志物。这一研究发现拉开了全球众多研究者开始探索循环miRNA作为无创标志物的大幕。现有研究证实了循环miRNA在包括肿瘤、心血管病等众多疾病中的潜在诊断价值。然而，目前循环miRNA在桥本氏甲状腺炎中的诊断作用却较少有报道。因此，本研究利用Exiqon miRNA qPCR panel芯片以及qRT-PCR法，通过对大样本的桥本甲状腺炎样本的研究，旨在寻找对桥本甲状腺炎具有潜在诊断价值的血浆miRNA。若根据这类miRNA设计针对于桥本甲状腺炎的诊断试剂盒，将会推动我国桥本甲状腺炎的诊治水平，也为将来对桥本甲状腺炎的进一步研究提供思路。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种与桥本甲状腺炎辅助诊断相关的血浆miRNA标志物。

本发明的另一目的在于提供上述血浆miRNA标志物及其引物在制备桥本甲状腺炎辅助诊断试剂盒以及在制备治疗桥本甲状腺炎的药物中的应用。

本发明的又一目的在于提供用于桥本甲状腺炎辅助诊断和治疗的试剂盒及药物。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种与桥本甲状腺炎辅助诊断相关的血浆miRNA标志物，该血浆miRNA标志物为miR-205(uccuucauuccaccggagucug)，miR-20a-3p(acugcauuaugagcacuuaaag)，miR-375(uuuguucguucggcucgcguga)，miR-296(agggcccccccucaauccugu)，miR-451(aaaccguuaccauuacugaguu)和miR-500a(uaauccuugcuaccugggugaga)中的一种或多种，如miR-375、miR-451和miR-500a的组合，或miR-20a-3p。该血浆miRNA标志物优选为miR-205，miR-20a-3p，miR-375，miR-296，miR-451和miR-500a中两种或两以上的组合，进一步优选为miR-205，miR-20a-3p，miR-375，miR-296，miR-451和miR-500a六种miRNA所组成的组合。

上述的血浆miRNA标志物在辅助诊断桥本甲状腺炎中的应用。

上述的血浆miRNA标志物在制备桥本甲状腺炎辅助诊断试剂盒或治疗桥本甲状腺炎药物中的应用。

一种与桥本甲状腺炎辅助诊断相关的血浆miRNA标志物的引物，该引物包含miR-205，miR-20a-3p，miR-375，miR-296，miR-451和miR-500a中的一种或多种miRNA的引物；优选为包含血浆miRNA中miR-205，miR-20a-3p，miR-375，miR-296，miR-451和miR-500a中两种或两以上miRNA的引物；进一步优选为包含血浆miRNA中miR-205，miR-20a-3p，miR-375，miR-296，miR-451和miR-500a六种miRNA的引物。

上述的引物在辅助诊断桥本甲状腺炎或制备桥本甲状腺炎辅助诊断试剂盒中的应用。

一种桥本甲状腺炎辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测血浆miR-205，miR-20a-3p，miR-375，miR-296，miR-451和miR-500a中的一种或多种miRNA；优选为用于检测血浆miR-205，miR-20a-3p，miR-375，miR-296，miR-451和miR-500a中两种或两种以上miRNA；进一步优选为用于检测血浆中miR-205，miR-20a-3p，miR-375，miR-296，miR-451和miR-500a六种miRNA。

一种桥本甲状腺炎辅助诊断试剂盒，该试剂盒中含有血浆miR-205，miR-20a-3p，miR-375，miR-296，miR-451和miR-500a中的一种或多种miRNA的引物；优选为含有血浆miRNA中miR-205，miR-20a-3p，miR-375，miR-296，miR-451和miR-500a中两种或两种以上miRNA的引物；进一步优选为含有血浆miRNA中miR-205，miR-20a-3p，miR-375，miR-296，miR-451和miR-500a六种miRNA的引物。

该试剂盒还可以包括PCR技术常用试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl₂，DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。

本发明所涉及的与桥本甲状腺炎诊断相关的血浆miRNA标志物miR-205，miR-20a-3p，miR-375，miR-296，miR-451和miR-500a中的每种miRNA的序列均已公开，但是将各miRNA标志物单独或进行组合作为桥本甲状腺炎辅助诊断标志物需要本领域技术人员付出创造性劳动。各miRNA标志物的扩增引物均可通过市场购买获得，本发明实施例中使用的血浆miRNA标志物的引物为购自广州锐博公司所合成生产的特异性miRNA茎环RT-PCR引物。

具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)血浆miRNA差异表达谱分析：分析桥本甲状腺炎和正常对照人群中差异表达的血浆miRNA，并对差异表达miRNAs进行进一步大样本多阶段验证。(3)通过多阶段的验证，明确这些miRNA诊断桥本甲状腺炎的能力。(4)血浆miRNA诊断试剂盒的研制：根据桥本甲状腺炎与正常人群血浆中的差异表达miRNA开发miRNAs诊断试剂盒，实现对桥本甲状腺炎患者的无创辅助诊断，为将来研制可能与这些miRNA相关的治疗桥本甲状腺炎的药物提供依据。

本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料，并采用了Exiqon miRNA qPCR panel芯片以及qRT-PCR方法等。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.研究样本选择：初治的，经内分泌科医生根据过氧化物酶抗体(TPOAb的)和抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)阳性化验结果确认为桥本甲状腺炎的病人。正常对照为在医院进行体检的正常人群。

2.Exiqon miRNA qPCR panel芯片初筛：利用TRIZOL-LS试剂对血浆混合样本进行RNA提取，并进行qRT-PCR操作获得初筛结果。

3.训练集和验证集：利用AM1556试剂盒(ABI公司)对每个血浆样本进行RNA提取，通过逆转录反应得到cDNA样品，加入PCR引物和SYBR Green荧光染料进行PCR反应。通过比对标准品的Ct值，得出样本中的miRNA含量。

4.统计分析：运用χ²检验、配对t检验以及非参数秩和检验比较miRNA表达水平在不同研究组中的差异。通过计算风险值和ROC曲线分析证实血浆miRNA的诊断价值。

本发明研究组目前通过对桥本甲状腺炎病人的外周血浆中的miRNA进行系统的表达分析，现已发现了一组6个具有临床诊断潜能的桥本甲状腺炎血浆microRNA标记物(miR-205，miR-20a-3p，miR-375，miR-296，miR-451和miR-500a)。

本发明的有益效果：

1.血浆miRNA作为新型的生物标志物，具有稳定性好、微创易获取，灵敏性和特异性高的特点。这类分子标志物的开发利用将为包括桥本甲状腺炎在内的各种疾病的诊断以及进一步治疗提供新的方向。

2.研究者通过Exiqon miRNA qPCR panel芯片以及qRT-PCR法，对桥本甲状腺炎和正常对照人群血浆中的差异表达miRNA进行严密、多阶段的验证和评价。证实了这组miRNA作为诊断桥本甲状腺炎的无创标记物的可靠性以及可重复性。

3.研究者发现miR-375、miR-451和miR-500a与HT患者促甲状腺激素(TSH)水平相关，而miR-20a-3p的表达水平与抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)水平相关。显示了这组miRNA与桥本甲状腺炎之间的紧密关系。这些结果将给未来研究这些miRNA对于桥本甲状腺炎的机制以及针对这些miRNA对于桥本甲状腺炎的治疗提供新的思路。

附图说明

图1：实验流程图

图2：在桥本甲状腺炎血浆中高表达的6个miRNA

图3：对所获得的miRNA进行ROC曲线分析。

A：训练集与验证集的合集；B：训练集；C：验证集。

具体实施方式

发明人于2013年至2014年从南京医科大学第一附属医院收集了大量的桥本甲状腺炎患者和正常体检人群的静脉血浆样品，通过对样品资料的整理，从中选择了100例桥本甲状腺炎和100例正常对照的样本作为Exiqon miRNA qPCR panel芯片初筛和后续一系列qRT-PCR验证的实验样品。所选择的患者血浆样本均来自于初治的，经内分泌科医生根据过氧化物酶抗体(TPOAb的)和抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)阳性化验结果确认为桥本甲状腺炎的病人。并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料。

参照流程图(图1)，从桥本甲状腺炎以及正常对照血浆样本中随机选择了20例桥本甲状腺炎样本以及10例正常对照，并且分别混合成了2例桥本甲状腺炎血浆混合样本和1个正常混合样本(一个混合样本由10例200ul血浆样本汇合形成2ml的样本)。对这3例混合样本进行Exiqon miRNA qPCR panel芯片初筛和分析，具体步骤参照Exiqon miRNA qPCR panel芯片的说明书：

1.血浆抽提

取出血浆样品，样品化冻后3000x g离心5min去除一些碎片及一些不溶成分。转移250ul上清至新的1.5ml管中，加入750ul TRIZOL-LS后，剧烈震荡5s。

2.两相分离

匀浆后样品于15到30℃孵育5分钟。每1ml的TRIZOL-LS试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下13,000g离心15分钟。

3.RNA沉淀

将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为：1ml TRIZOL-LS试剂匀浆的样品中加0.5ml的异丙醇和5ul的糖元。4℃静置半小时，让RNA尽可能的析出。于4℃13,000g离心15分钟。

4.RNA清洗

移去上清液，每1ml TRIZOL-LS试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％(v/v)乙醇，清洗RNA沉淀。静置10分钟，然后4℃下10000g离心5分钟。

5.重新溶解RNA沉淀

去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟。

6.测量浓度：

通常能得到～5μg RNA/50ml血清。

7.cDNA合成

(1)稀释模板RNA：使用DEPC水将20－25ng模板RNA稀释至14ul(终浓度为1.492－1.786ng/μl)。

(2)准备反应液：将5×Reaction Buffer以及DEPC水置于冰上溶解，并震荡混匀。Enzyme mix置于-20℃冰盒，使用前轻弹混匀后置于冰上。所有试剂均离心后使用。

(3)配置反应液：配置下表中的反应液

(4)混合并离心试剂：震荡或者抽吸混匀反应液后离心，以保证所有溶液彻底混合均匀。

(5)逆转录反应及热失活：将反应液于42℃温育60分钟后，于95℃温育5分钟以失活逆转录酶。

8.Real-Time PCR

试剂：

Nuclease free water(Exiqon)

SYBR^TM Green master mix(Exiqon)

cDNA模板

ROX(Invitrogen)

miRNA PCR ARRAY(Exiqon)

仪器：

ABI PRISM7900system(Applied Biosystems)

(1)准备Real-time PCR试剂：将制备的cDNA模板，DEPC水和SYBR^TM Green master mix置于冰上溶解15-20分钟。

(2)稀释cDNA模板：将RT反应获得的cDNA模板用nuclease free water稀释110倍(例如，向20μl反应液中加入2180ul nuclease free water)。

(3)混合所有反应试剂：

A.将PCR板简单离心后，移去封膜。

B.将110倍稀释的cDNA模板与2×SYBR Green master mix按照1：1体积比混合。

C.倒置混匀反应液并离心

D.将混合反应液加入板中的每个孔

E.重新封好PCR板

(4)将PCR板简单低温离心

(5)Real-time PCR扩增：根据下表中的反应条件进行Real-time PCR扩增和溶解曲线分析。

Real-time PCR循环条件如下表：

数据分析：采用ΔΔCt方法

使用PCR仪器附带的软件进行初步数据分析，获得原始的Cq值(Cp或Ct，依仪器不同名称可能不同)。

我们建议使用GenEx qPCR分析软件(www.exiqon.com/mirna-pcr-analysis)对数据进行标准和深入的数据分析。

a.计算每个处理组中的每个通路相关基因的ΔCt。

ΔCt(group 1)＝average Ct–average of HK genes’Ct for group 1array

ΔCt(group 2)＝average Ct–average of HK genes’Ct for group 2array

b.计算2个PCR Array(或两组)中每个基因的ΔΔCt。

ΔΔCt＝ΔCt(组2)-ΔCt(组1)

备注：通常组1是对照，组2是实验组。

c.通过2-ΔΔCt计算组2与组1对应基因的表达差异。

在芯片初筛后，得到了如下表中的28个差异表达miRNA(4个桥本甲状腺炎血浆混合样本中相对于正常样本都超过了1.5倍差异)：

同时，我们从既往文献中选取了4个miRNA(miR-21，miR-22，miR-375和miR-425)。对于这一共32个miRNA，通过训练集和验证集，采用qRT-PCR法进行验证，具体步骤为：

1.血浆RNA提取：选用ABI公司血浆RNA提取试剂盒(AM1556)，参照试剂盒说明，每个样本吸取200ul进行提取RNA，并最后用100ul DEPC水进行溶解。

2.cDNA的制备：

1)采用50μL反应体系进行逆转录实验

2)上述反应之后再反应体系中再加入如下反应物

3.qPCR

1)采用5μL反应体系，按以下比例进行试验

反应体系混匀，瞬时离心后，放置于实时定量PCR仪中，以下列程序进行反应：

反应结束后添加溶解曲线。

数据分析：以miR-16作为内参，采用2^-ΔΔCt法相对定量法。利用SPSS 16.0软件进行统计分析，得到了一组在训练集，验证集中都一致于桥本甲状腺炎血浆中高表达的6个miRNA：miR-205，miR-20a-3p，miR-375，miR-296，miR-451和miR-500a(在训练集和验证集中P值都小于0.05，图2)。如图3，这6个miRNA组成的分子标志物能够很好的区分桥本甲状腺炎患者和正常人群。

运用卡方检验分析发现，研究者发现miR-375、miR-451和miR-500a与HT患者促甲状腺激素(TSH)水平相关，而miR-20a-3p的表达水平与抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)水平相关。

试剂盒包括一批血浆miRNA qRT-PCR引物，还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水，荧光探针，RNA酶抑制剂，Taq酶等，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如定量标化的正常人样本等)。此试剂盒的价值在于只需要血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光法检测血浆样本中miRNA的表达含量，来辅助诊断该样本来源患者的罹患桥本甲状腺炎的可能性。血浆miRNA不仅稳定，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断以及进一步的个体化治疗。