一种利用较低血清含量营养物培养DF1细胞以制备鸡传染性法氏囊病毒的方法与流程

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种利用较低血清含量营养物培养DF1细胞以制备鸡传染性法氏囊病毒的方法。

背景技术：

DF1细胞为鸡胚传代细胞系，体外培养呈纤维状贴壁细胞，该细胞对鸡传染性法氏囊病毒较为敏感，可用于鸡传染性法氏囊病毒疫苗的制备。目前，培养DF1细胞的用于制备疫苗主要采用的是转瓶工艺，培养基一般采用DMEM、DMEM/F12添加10％血清进行培养。

目前，鸡传染性法氏囊病毒细胞灭活疫苗的生产主要采用转瓶培养技术，或者是先进的生物反应器悬浮培养技术，均采用高血清含量细胞培养技术，动物来源成分带来的疫苗安全、成本、质量等问题已经日益显著，主要表现在：1)牛血清用量大，细胞生长对血清具有一定的依赖性，增加生产成本，血清批间组分存在差异，直接影响产品质量的稳定性；2)血清来源于动物，有可能携带外源病毒，对生长的细胞和疫苗产品都有可能带来危险。因此细胞培养过程中降低血清的使用量是节约生产成本和提高疫苗品质稳定性的关键。

技术实现要素：

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种利用较低血清含量营养物培养DF1细胞以制备鸡传染性法氏囊病毒的方法，以解决现有技术中当利用DF1细胞作为宿主细胞制备鸡传染性法氏囊病毒时，对DF1细胞的培养所需血清量较大的技术问题。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种利用较低血清含量营养物培养DF1细胞以制备鸡传染性法氏囊病毒的方法，包括以下步骤：

1)取DF1细胞，接种于含有8％(v/v)新生牛血清、10mg/L纤连蛋白的DMEM/F12培养基，培养过程中更换若干次培养基，每次更换的培养基中新生牛血清含量不变、而纤连蛋白含量较前次低，直至更换为含有8％(v/v)新生牛血清的DMEM/F12培养基，即得到第一代驯化细胞；

2)取所述第一代驯化细胞，接种于含有6％(v/v)新生牛血清、20mg/L纤连蛋白的DMEM/F12培养基，培养过程中更换若干次培养基，每次更换的培养基中新生牛血清含量不变、而纤连蛋白含量较前次低，直至更换为含有6％(v/v)新生牛血清的DMEM/F12培养基，即得到第二代驯化细胞；

3)取所述第二代驯化细胞，接种于含有4％(v/v)新生牛血清、30mg/L纤连蛋白的DMEM/F12培养基，培养过程中更换若干次培养基，每次更换的培养基中新生牛血清含量不变、而纤连蛋白含量较前次低，直至更换为含有4％(v/v)新生牛血清的DMEM/F12培养基，即得到第三代驯化细胞；

4)取所述第三代驯化细胞，接种于含有2％(v/v)新生牛血清、40mg/L纤连蛋白的DMEM/F12培养基，培养过程中更换若干次培养基，每次更换的培养基中新生牛血清含量不变、而纤连蛋白含量较前次低，直至更换为含有2％(v/v)新生牛血清的DMEM/F12培养基，即得到第四代驯化细胞；

5)取步骤4所述第四代驯化细胞，接种鸡传染性法氏囊病毒，以含有0～2％(v/v)新生牛血清的DMEM/F12培养基培养，收获培养物。

作为优选，步骤1)所使用的DF1细胞是通过以下方式前处理得到的：取已在细胞瓶上长满单层的DF1细胞，经EDTA-胰酶消化，加入10mL细胞生长液，吹打分散细胞，将DF1细胞置于温度37℃二氧化碳培养箱中进行培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行扩大培养。

作为优选，所述细胞生长液是含有10％(v/v)新生牛血清的DMEM/F12培养液。

作为优选，步骤1)中所述含有8％(v/v)新生牛血清、10mg/L纤连蛋白的DMEM/F12培养基是通过将含有10％(v/v)新生牛血清的DMEM/F12培养基与含有50mg/L纤连蛋白的DMEM/F12培养基以4:1(v/v)的比例混合得到的。

作为优选，步骤2)中所述含有6％(v/v)新生牛血清、20mg/L纤连蛋白的DMEM/F12培养基是通过将含有10％(v/v)新生牛血清的DMEM/F12培养基与含有50mg/L纤连蛋白的DMEM/F12培养基以3:2(v/v)的比例混合得到的。

作为优选，步骤3)中所述含有4％(v/v)新生牛血清、30mg/L纤连蛋白的DMEM/F12培养基是通过将含有10％(v/v)新生牛血清的DMEM/F12培养基与含有50mg/L纤连蛋白的DMEM/F12培养基以2:3(v/v)的比例混合得到的。

作为优选，步骤4)中所述含有2％(v/v)新生牛血清、40mg/L纤连蛋白的DMEM/F12培养基是通过将含有10％(v/v)新生牛血清的DMEM/F12培养基与含有50mg/L纤连蛋白的DMEM/F12培养基以1:4(v/v)的比例混合得到的。

作为优选，步骤5)具体包括以下操作：以含有0～2％(v/v)新生牛血清的DMEM/F12培养基步骤4)所得的第四代驯化细胞，至DF1细胞长满单层时，以1％(v/v)的比例接种鸡传染性法氏囊病毒强毒，控制温度在37℃继续培养，当DF1细胞出现80％以上病变时，收获细胞培养物。

作为优选，所述EDTA-胰酶是含有0.05～0.25％(w/v)胰酶的PBS溶液。

作为优选，步骤5)所述含有0～2％(v/v)新生牛血清的DMEM/F12培养基中还含有100～200IU/mL的抗生素，所述含有0～2％(v/v)新生牛血清的DMEM/F12培养基pH为7.2～7.4。

在以上技术方案的基础上，还可以包括步骤6)收获病毒液的处理：收获的病毒液反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液，取部分病毒液进行无菌检验和效价测定，剩余病毒液置-70℃冰箱保存。

进一步的，还可以包括收对步骤6)产物TCID₅₀的测定：用无血清的细胞培养液将收获的IBDV毒液做10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-8 4个稀释度接种DF1细胞，每个稀释度接种8孔，每孔0.1mL，吸附1h，每孔补加0.1mL维持液，37℃培养72h。观察DF1细胞病变，计算TCID₅₀。

本发明的有益效果主要体现在以下几方面：

1、本发明通过添加纤连蛋白(FN)可使DF1细胞适应DMEM/F12低血清的培养环境，细胞稳定增值后可逐级去除纤连蛋白，驯化筛选到适用于低血清培养的具有优质性能的DF1细胞。

2、降低血清培养的DF1细胞在细胞增殖密度和繁殖鸡传染性法氏囊病毒的能力上均不受影响，且维持液中的血清含量可降低为0％。

3、由于驯化得到的DF1细胞适应低血清培养和无血清病毒增殖，可显著降低生产成本，并且能够快速稳定的扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。

附图说明

图1是本发明实施例1中对照组(即血清含量为10％的DMEM/F12培养基培养的DF1细胞)生长情况镜检图。

图2是本发明实施例1中利用血清含量为8％的DMEM/F12培养基培养的DF1细胞生长情况镜检图。

图3是本发明实施例1中利用血清含量为6％的DMEM/F12培养基培养的DF1细胞生长情况镜检图。

图4是本发明实施例1中利用血清含量为4％的DMEM/F12培养基培养的DF1细胞生长情况镜检图。

图5是本发明实施例1中利用血清含量为2％的DMEM/F12培养基培养的DF1细胞生长情况镜检图。

图6是本发明实施例1细胞种毒繁殖过程中，当DF1细胞出现80％以上病变时的DF1细胞生长情况镜检图。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1

一种利用较低血清含量营养物培养DF1细胞以制备鸡传染性法氏囊病毒的方法，包括以下步骤：

S1.制备用细胞的传代与培养:

取已在T25细胞瓶上长满单层的鸡胚传代细胞系DF1细胞，经0.05％的EDTA-胰酶消化细胞，加入10mL细胞生长液，吹打分散细胞，将DF1细胞置于温度37℃二氧化碳培养箱中进行培养72h，待形成良好的细胞单层时，进行扩大培养，上述的细胞生长液为10％新生牛血清含量的DMEM/F12培养液。

S2.驯化细胞适应低血清培养基：包括以下步骤：

S2.1第一代细胞的驯化：

将步骤S1扩大培养的DF1细胞接种到第一代低血清培养基中进行驯化，所述的第一代低血清培养基为含有10％新生牛血清的DMEM/F12与含有50mg/L纤连蛋白(FN)的DMEM/F12比例为4∶1的混合培养液，其中新生牛血清的含量为8％，并扩大培养将纤连蛋白(FN)的含量进行50mg/L、40mg/L、30mg/L、20mg/L、10mg/L、0mg/L逐级递减，使DF1细胞适应含有8％新生牛血清的DMEM/F12培养基。

S2.2第二代细胞的驯化：

将驯化的第一代DF1细胞接种到第二代低血清培养基中进行驯化，所述的第二代低血清培养基为含有10％新生牛血清的DMEM/F12与含有50mg/L纤连蛋白(FN)的DMEM/F12比例为3∶2的混合培养液，其中新生牛血清的含量为6％，并扩大培养将纤连蛋白(FN)的含量进行50mg/L、40mg/L、30mg/L、20mg/L、10mg/L、0mg/L逐级递减，使DF1细胞适应含有6％新生牛血清的DMEM/F12培养基。

S2.3第三代细胞的驯化：

将驯化的第二代DF1细胞接种到第三代低血清培养基中进行驯化，所述的第三代低血清培养基为含有10％新生牛血清的DMEM/F12与含有50mg/L纤连蛋白(FN)的DMEM/F12比例为2∶3的混合培养液，其中新生牛血清的含量为4％，并扩大培养将纤连蛋白(FN)的含量进行50mg/L、40mg/L、30mg/L、20mg/L、10mg/L、0mg/L逐级递减，使DF1细胞适应含有4％新生牛血清的DMEM/F12培养基。

S2.4第四代细胞的驯化：

将驯化的第三代DF1细胞接种到第四代低血清培养基中进行驯化，所述的第四代低血清培养基为含有10％新生牛血清的DMEM/F12与含有50mg/L纤连蛋白(FN)的DMEM/F12比例为1∶4的混合培养液，其中新生牛血清的含量为2％，并扩大培养将纤连蛋白(FN)的含量进行50mg/L、40mg/L、30mg/L、20mg/L、10mg/L、0mg/L逐级递减，使DF1细胞适应含有2％新生牛血清的DMEM/F12培养基。

S3.驯化细胞适应低血清培养环境：

将成功驯化的降低血清培养的DF1细胞扩大培养并冻存细胞，及制备生产用种子细胞。

S4.细胞种毒的繁殖

降低血清培养的DF1细胞长满单层时，按细胞悬液1％的比例接种本实验室分离、鉴定的鸡传染性法氏囊病毒强毒山东株(SD)，控制温度在37℃，接毒时维持液为含有0％新生牛血清的DMEM/F12，当DF1细胞出现80％以上病变时，收获细胞培养物。

S5.收获病毒液的处理：

收获的病毒液反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液，取部分病毒液进行无菌检验和效价测定，剩余病毒液置-70℃冰箱保存。

S6.收获病毒液的TCID₅₀测定：

用无血清的细胞培养液将收获的IBDV毒液做10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-84个稀释度接种DF1细胞，每个稀释度接种8孔，每孔0.1mL，吸附1h，每孔补加0.1mL维持液，37℃培养72h。观察DF1细胞病变，计算TCID₅₀。

实施例2

本实施例用于考察实施例1驯化DF1细胞的驯化效果

将经过降血清培养的DF1细胞，血清添加比例为8％、6％、4％、2％，经逐级降低纤连蛋白(FN)的含量直至FN的含量为0时，37℃二氧化碳培养箱培养，对照组为血清含量为10％的DMEM/F12培养的DF1细胞。

表1：DMEM/F12降低血清驯化DF1细胞效果

由表1可知：除2％血清含量的DF1细胞大幅度低于对照组的分种比例和细胞平均收获量，8％、6％、4％血清含量的DF1细胞的分种比例与细胞平均收获量均与对照组相似。

实施例3

本实施例用于考察DF1细胞经降低血清驯化后所制备的鸡传染性法氏囊病毒效价水平。

将经过降低血清培养的DF1细胞，血清添加比例为8％、6％、4％、2％，经逐级降低纤连蛋白(FN)的含量直至FN的含量为0时，接种比例为1％本实验室分离、鉴定的鸡传染性法氏囊病毒强毒山东株(SD)，维持液为含有0％血清含量的DMEM/F12，对照组维持液为含有2％血清的DMEM/F12。

表2.驯化后DF1细胞繁殖鸡传染性法氏囊病毒情况

实施例4

本实施例用于评估以上实施例1～3制备过程的成本

以100L培养体积为例，对原工艺和降低血清驯化后工艺进行成本对比，对培养液和维持液的成本进行估算和比较，具体结果如下：

表3：成本估算

实施例5

一种利用较低血清含量营养物培养DF1细胞以制备鸡传染性法氏囊病毒的方法，包括以下步骤：

1)取DF1细胞，接种于含有8％(v/v)新生牛血清、10mg/L纤连蛋白的DMEM/F12培养基，培养过程中更换若干次培养基，每次更换的培养基中新生牛血清含量不变、而纤连蛋白含量较前次低，直至更换为含有8％(v/v)新生牛血清的DMEM/F12培养基，即得到第一代驯化细胞；

2)取所述第一代驯化细胞，接种于含有6％(v/v)新生牛血清、20mg/L纤连蛋白的DMEM/F12培养基，培养过程中更换若干次培养基，每次更换的培养基中新生牛血清含量不变、而纤连蛋白含量较前次低，直至更换为含有6％(v/v)新生牛血清的DMEM/F12培养基，即得到第二代驯化细胞；

3)取所述第二代驯化细胞，接种于含有4％(v/v)新生牛血清、30mg/L纤连蛋白的DMEM/F12培养基，培养过程中更换若干次培养基，每次更换的培养基中新生牛血清含量不变、而纤连蛋白含量较前次低，直至更换为含有4％(v/v)新生牛血清的DMEM/F12培养基，即得到第三代驯化细胞；

4)取所述第三代驯化细胞，接种于含有2％(v/v)新生牛血清、40mg/L纤连蛋白的DMEM/F12培养基，培养过程中更换若干次培养基，每次更换的培养基中新生牛血清含量不变、而纤连蛋白含量较前次低，直至更换为含有2％(v/v)新生牛血清的DMEM/F12培养基，即得到第四代驯化细胞；

5)取步骤4所述第四代驯化细胞，接种鸡传染性法氏囊病毒，以含有2％(v/v)新生牛血清的DMEM/F12培养基培养，收获培养物。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。