本发明涉及生物化妆品技术领域，更具体的说是涉及一种用于皮肤护理和保养的胎盘亚全能干细胞培养液的制备。
背景技术：
干细胞是一类具有自我复制和多向分化特征的始祖细胞。干细胞是人体基本的结构单位和功能单位，由此可知干细胞是人体各种组织器官的起源细胞。人体从受精卵发育到胎儿，从胎儿发育到成年的整个过程中，干细胞逐级丧失其全能性，从全能的胚胎干细胞形成亚全能干细胞、多能干细胞以及专能干细胞；这些处于不同发育阶段的干细胞在人体组织器官的发育、生长、损伤、修复过程中发挥着决定性的作用，因此可以说干细胞能够促使机体活力旺盛，令机体保持健康状态。
胎盘亚全能干细胞属于成体干细胞范畴，来源于新生儿胎盘组织的一族亚全能干细胞，可以用于药物、毒物的检测系统；药物和基因的靶向转运系统；整容美容领域。鉴于胎盘亚全能干细胞广阔的应用前景，针对目前市面上的皮肤护理产品多为精细化工产品，初始原料中杂质残留较多，功效成分本身的生物活性低且难以维持，改善皮肤生理状态的效果不佳，并且部分产品长期使用甚至会对皮肤产生损害的情况，可以将胎盘亚全能干细胞应用于皮肤护理产品中。
因此，如何提供一种不仅可以保证生物活性和安全性，而且对皮肤有很好护理和保养效果的产品是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种用于皮肤护理和保养的胎盘亚全能干细胞培养液的制备方法，本发明制备的胎盘亚全能干细胞培养液不仅含有丰富的活性物质，可以护理和保养皮肤，而且可以促进皮肤的修复再生，加强皮肤的新陈代谢。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于皮肤护理和保养的胎盘亚全能干细胞培养液的制备，具体包括如下步骤：
(1)将采集的人类胎盘组织通过无菌方式进行剪断破碎为＜5mm3的小块胎盘组织；
(2)在37℃的条件下用5mg/mL的胰蛋白酶对小块胎盘组织进行消化降解30min，降解期间温和震荡5次，降解结束后，通过细胞筛离心收集细胞悬液；
(3)采用磁式细胞分选法对细胞悬液进行分离，首先使用CD184+磁珠进行阴性选择得到CD184-细胞，然后用CD151-磁珠分离得到CD151+CD184-细胞，最后用Oct4-磁珠分离出目的细胞，即胎盘亚全能干细胞；
(4)将分离出的胎盘亚全能干细胞接种于装有干细胞培养液的无菌塑料培养瓶中进行原代培养，培养时间为3天，细胞正常长满瓶底后，原代培养结束；
(5)用0.25％W/V的胰蛋白酶对原代培养的细胞进行酶解消化1min，然后加入干细胞培养液终止酶解并吹打细胞，得到原代培养酶解液；
(6)原代培养酶解液与干细胞培养液以1∶3的体积比混合后置于无菌塑料培养瓶中进行传代培养，每代培养时间为3天，培养代次为四代；
(7)将传代培养至第四代的无菌塑料培养瓶中的细胞上清液收集到无菌瓶中，并在设置有0.22μm的无菌混合纤维滤膜的过滤装置中进行过滤，得到过滤后的细胞上清液；
(8)向过滤后的细胞上清液中添加3-5mg/L，分子量为180-3000道尔顿的小分子胶原蛋白肽，即得到胎盘亚全能干细胞培养液。
优选的，在上述用于皮肤护理和保养的胎盘亚全能干细胞培养液的制备中，所述干细胞培养液是由60-70％体积的无血清无酚红DMEM/F12培养液和30-40％体积的MCDB-201培养液混合，再添加下列终浓度组分的10-100μg/mL的亚麻酸、10-100μg/mL的亚油酸、1-5％体积的非必需氨基酸、1-10mmol/L 的谷氨酰胺、10-100ng/mL的人表皮细胞生长因子、10-100ng/mL的肝细胞生长因子、10-100ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子配制而成。
优选的，在上述用于皮肤护理和保养的胎盘亚全能干细胞培养液的制备中，所述胎盘亚全能干细胞在所述无菌塑料培养瓶中贴壁生长，表达Oct4、Sox2、Nanog、c-Myc、Nestin、CD90、CD29、CD13、CD166、CD105，不表达CD184、CD31、CD34、CD45、CD133、CD106、CD11b、CD271、HLA-II，可以向人体内、中、外胚层组织分化，包括但不限于血管、神经、肝脏、心肌、骨、软骨和脂肪组织分化。
优选的，在上述用于皮肤护理和保养的胎盘亚全能干细胞培养液的制备中，所述无菌塑料培养瓶的体积为75cm2。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开了一种用于皮肤护理和保养的胎盘亚全能干细胞培养液的制备方法，首先是将来源于人类的胎盘组织进行剪断破碎，破碎后通过胰蛋白酶对其降解、过筛，然后用常规的磁式细胞分选法分离得到原代单个核细胞，即用于细胞培养的胎盘亚全能干细胞；最后将得到的胎盘亚全能干细胞接种至干细胞培养液中进行原代培养、传代培养，培养结束后将培养瓶中的上清液收集并过滤，过滤后在滤液中添加小分子的胶原蛋白肽，即制得胎盘亚全能干细胞培养液。本发明提供的胎盘亚全能干细胞培养液中未添加细胞培养常用的胎牛血清，并且整个制备过程中未添加抗生素，保证了使用的安全性，防止了因异种蛋白过敏或抗生素过敏而引发的安全性问题。
本发明在制备胎盘亚全能干细胞培养液的过程中，一方面选用的是传代培养第四代细胞培养的上清液，保证了不仅生物活性高，而且活性物质含量丰富；并且将第四代的细胞培养上清液收集之后用0.22μm的无菌混合纤维滤膜进行过滤，清除了上清液中对皮肤有伤害的物质，如残留微生物、干细胞或者大型碎片，保证了使用的安全性；另一方面在过滤后的上清液中添加了小分子胶原蛋白肽，分子量为180-3000道尔顿，不仅可以增强皮肤的吸收效果，更好的锁住水分，让皮肤时刻处于湿润状态，而且可以提升皮肤亮度，实现美白的效果。因此，本发明可以有效的对皮肤进行护理和保养，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种不仅含有丰富的活性物质，可以对皮肤进行安全有效的护理和保养，而且可以促进皮肤的修复再生，加强皮肤的新陈代谢，让皮肤时刻保持湿润，提升皮肤亮度，实现美白效果的胎盘亚全能干细胞培养液。
本发明提供的一种用于皮肤护理和保养的胎盘亚全能干细胞培养液的制备，具体包括如下步骤：
(1)将采集的人类胎盘组织通过无菌方式进行剪断破碎为＜5mm3的小块胎盘组织；
(2)在37℃的条件下用5mg/mL的胰蛋白酶对小块胎盘组织进行消化降解30min，降解期间温和震荡5次，降解结束后，通过细胞筛离心收集细胞悬液；
(3)采用磁式细胞分选法对细胞悬液进行分离，首先使用CD184+磁珠进行阴性选择得到CD184-细胞，然后用CD151-磁珠分离得到CD151+CD184-细胞，最后用Oct4-磁珠分离出目的细胞，即胎盘亚全能干细胞；
(4)将分离出的胎盘亚全能干细胞接种于装有干细胞培养液的无菌塑料培养瓶中进行原代培养，培养时间为3天，细胞正常长满瓶底后，原代培养结束；
(5)用0.25％W/V的胰蛋白酶对原代培养的细胞进行酶解消化1min，然后加入干细胞培养液终止酶解并吹打细胞，得到原代培养酶解液；
(6)原代培养酶解液与干细胞培养液以1∶3的体积比混合后置于无菌塑料培养瓶中进行传代培养，每代培养时间为3天，培养代次为四代；
(7)将传代培养至第四代的无菌塑料培养瓶中的细胞上清液收集到无菌瓶中，并在设置有0.22μm的无菌混合纤维滤膜的过滤装置中进行过滤，得到过滤后的细胞上清液；
(8)向过滤后的细胞上清液中添加3-5mg/L，分子量为180-3000道尔顿的小分子胶原蛋白肽，即得到胎盘亚全能干细胞培养液。
为了进一步优化上述技术方案，干细胞培养液是由60-70％体积的无血清无酚红DMEM/F12培养液和30-40％体积的MCDB-201培养液混合，再添加下列终浓度组分的10-100μg/mL的亚麻酸、10-100μg/mL的亚油酸、1-5％体积的非必需氨基酸、1-10mmol/L的谷氨酰胺、10-100ng/mL的人表皮细胞生长因子(EGF)、10-100ng/mL的肝细胞生长因子(HGF)、10-100ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)配置而成的。
为了进一步优化上述技术方案，胎盘亚全能干细胞在无菌塑料培养瓶中贴壁生长，表达Oct4、Sox2、Nanog、c-Myc、Nestin、CD90、CD29、CD13、CD166、CD105，不表达CD184、CD31、CD34、CD45、CD133、CD106、CD11b、CD271、HLA-II，可以向人体内、中、外胚层组织分化，包括但不限于血管、神经、肝脏、心肌、骨、软骨和脂肪组织分化。
为了进一步优化上述技术方案，无菌塑料培养瓶的体积为75cm2。
具体实施例：
一种用于皮肤护理和保养的胎盘亚全能干细胞培养液的制备，具体包括如下步骤：
(1)将采集的人类胎盘组织通过无菌方式进行剪断破碎为＜5mm3的小块胎盘组织；
(2)在37℃的条件下用5mg/mL的胰蛋白酶对小块胎盘组织进行消化降解30min，降解期间温和震荡5次，降解结束后，通过细胞筛离心收集细胞悬液。
(3)采用磁式细胞分选法对细胞悬液进行分离，首先使用CD184+磁珠进行阴性选择得到CD184-细胞，然后用CD151-磁珠分离得到CD151+CD184-细胞，最后用Oct4-磁珠分离出目的细胞，即胎盘亚全能干细胞；
(4)干细胞培养液的配置：7L的无血清无酚红DMEM/F12培养液和3L的MCDB-201培养液混合，再添加下列终浓度组分的100μg/mL的亚麻酸、100μg/mL的亚油酸、5％体积的非必需氨基酸、10mmol/L的谷氨酰胺、100ng/mL的人表皮细胞生长因子(EGF)、100ng/mL的肝细胞生长因子(HGF)、100ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；
(5)将分离出的胎盘亚全能干细胞接种于装有干细胞培养液的无菌塑料培养瓶中进行原代培养，培养时间为3天，细胞正常长满瓶底后，原代培养结束；
(6)用0.25％W/V的胰蛋白酶对原代培养的细胞进行酶解消化1min，然后加入干细胞培养液终止酶解并吹打细胞，得到原代培养酶解液；
(7)原代培养酶解液与干细胞培养液以1∶3的体积比混合后置于无菌塑料培养瓶中进行传代培养，每代培养时间为3天，培养代次为四代；
(8)将传代培养至第四代的无菌塑料培养瓶中的细胞上清液收集到无菌瓶中，并在设置有0.22μm的无菌混合纤维滤膜的过滤装置中进行过滤，得到过滤后的细胞上清液；
(9)向过滤后的细胞上清液中添加5mg/L，并且分子量为180-3000道尔顿的小分子胶原蛋白肽，即得到胎盘亚全能干细胞培养液。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。