人皮肤来源的前体细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的方法与流程

本发明涉及人皮肤来源的前体细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的方法，属于组织工程及眼科修复技术领域。

背景技术：

在角膜的五层结构中，位于最内层的内皮层对于维持角膜透明及其正常的生理功能具有十分重要的意义，人角膜内皮细胞(human corneal endothelial cells,HCECs)通过泵功能和屏障功能，调控了角膜的透明性。但是由于成人角膜内皮细胞缺乏增殖能力，角膜内皮细胞受损后主要依赖损伤区周边细胞的扩展和移行进行修复，当细胞密度小于500-800/mm²个时则会引起角膜内皮失代偿，导致角膜持续水肿失去透明性。感染、炎症、外伤、眼部手术等都可引起内皮细胞损伤，但由于人类角膜内皮细胞的特殊生理特性，内皮细胞功能恢复常常是眼科疾病治疗的一大难题。通过穿透性角膜移植或角膜内皮移植，移植供体健康的，取代病变或受损的是目前治疗角膜内皮功能失代偿唯一有效的方法。鉴于目前可用于角膜移植手术的供体在全世界范围内极为匮乏，以及术后免疫排斥反应使其应用受到了限制。生物工程角膜可有效缓解天然角膜材料极其匿乏造成的压力，有着巨大的社会价值和经济价值。但无论是生物工程角膜内皮的构建还是单纯的内皮细胞移植，都需要充足的角膜内皮细胞供给。由于成人角膜内皮细胞缺乏增殖能力，且体外培养扩增能力有限，因此寻找新的内皮细胞来源成为亟待解决的问题。积极获取大量与正常人类似的功能性角膜内皮样细胞，满足细胞生物学研究及细胞替代治疗的需求，显得极为迫切。

目前关于角膜内皮细胞诱导分化的研究仍处于初期阶段。早期研究人员曾尝试利用脂肪间皮细胞、脐血间充质干细胞替代不可增殖的角膜内皮细胞，或将胚胎干细胞、角膜基质干细胞、骨髓内皮祖细胞、神经嵴细胞诱导分化为角膜内皮样细胞，但这些方法均存在某些问题，如免疫排斥，伦理问题，组织相容性差，缺乏动物实验等。目前仍未找到能够实现体外大量扩增功能性角膜内皮细胞的方法。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种诱导人皮肤来源的前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)分化为角膜内皮样细胞的方法。本发明利用人皮肤来源的前体细胞，通过与角膜内皮细胞B4G12的共培养，成功诱导出理论上接近正常人角膜内皮细胞的角膜内皮样细胞，并将获得的角膜内皮样细胞应用于角膜内皮失代偿动物模型，成功修复动物的角膜内皮层，具有重要的临床应用前景。

本发明的目的之一在于提供一种诱导人皮肤来源的前体细胞分化为角膜内皮样细胞的方法。

本发明的目的之二在于提供一种角膜内皮样细胞。

本发明的目的之三在于提供所获得的角膜内皮样细胞的应用。

本发明的目的还在于提供采用上述角膜内皮样细胞的角膜移植物。

具体的，本发明通过以下技术方案实现本发明的目的：

一种诱导人皮肤来源的前体细胞分化为角膜内皮样细胞的方法，其采用人皮肤来源的前体细胞与人角膜内皮细胞共培养，诱导人皮肤来源的前体细胞分化为角膜内皮样细胞。

首先，本发明直接采用人的皮肤来源的前体细胞SKPs进行诱导，以便避免可能产生的免疫排斥、伦理问题、组织相容性差等问题，更利于将来应用于临床；此外，选用人皮肤来源的前体细胞，目的还在于：人皮肤来源的前体细胞在体外随机分化的细胞中仅能偶尔见到神经样细胞，而小鼠的皮肤源性前体细胞就很容易分化为典型的神经元，说明在同样的培养条件下，人类的皮肤源性前体细胞和小鼠皮肤源性前体细胞不完全相同(刘桂英等，“人类皮肤来源前体细胞的表型和特征”，《中国组织工程研究》，第17卷，第36期)，采用小鼠皮肤源性前体细胞无法解决人角膜内皮细胞需求的问题。

其次，本发明采用人皮肤来源的前体细胞与人角膜内皮细胞共培养的诱导方式，该诱导方式避免了采用细胞因子及化学诱导剂所产生的细胞毒性问题，更适宜临床实验和应用；此外，本发明首次证实了通过人皮肤来源的前体细胞与人角膜内皮细胞共培养的这一诱导方式，可以产生角膜内皮样细胞。

其中优选的，人角膜内皮细胞为B4G12人角膜内皮细胞系，选用此细胞可避免提取原代人角膜内皮细胞的繁琐步骤和人角膜供体远远不能满足需求的问题，其属于商业化细胞系，便于大规模培养制备，因此更利用角膜内皮样细胞的工业化生产。

优选的，人皮肤来源的前体细胞与人角膜内皮细胞共培养方式为非接触式共培养；优选的，其中一个实施方式中采用transwell小室非接触式共培养。

具体的，所述方法包括如下步骤：

(1)人皮肤来源的前体细胞SKPs的培养；

(2)角膜内皮细胞B4G12的培养；

(3)角膜内皮样细胞的诱导。

其中步骤(1)人皮肤来源的前体细胞SKPs的培养可以采用本领域内已知的SKPs的获得及培养方式；

在其中一个实施方式中，本发明人皮肤来源的前体细胞SKPs的培养通过如下过程实现：

将皮肤组织用青霉素-链霉素冲洗消毒，剪成1mm×2mm的组织块，用Dispase酶4℃消化12-24h，将表皮去除得到真皮，胶原酶消化2-3h，用含胎牛血清的DMEM中和，将细胞解离后细胞筛网过滤，将细胞接种在培养瓶中，加入SKPs培养液，置于37℃，5％CO₂培养箱内培养。

其中优选的，SKPs培养液为DMEM/F12＝3:1的基础培养基,添加2％B27,40ng/ml bFGF,20ng/ml EGF,1％青链双抗。

步骤(2)角膜内皮细胞B4G12的培养，在其中一个实施方式中，采用如下过程实现：

将装有B4G12细胞的冻存管从超低温冰箱取出，迅速转移至37℃水浴锅内将管内冰块溶解，将冻存管内细胞悬液移至15ml离心管内，加入1ml B4G12细胞培养基，1000转/分钟离心5分钟后弃上清，再加入3ml B4G12细胞培养基重悬细胞沉淀，最后将细胞加入用10ug/ml层粘连蛋白及10mg/mL硫酸软骨素包被好的培养瓶内常规条件下培养，隔日换液。

所述的B4G12细胞培养基为人内皮细胞无血清培养基HE-SFM(购自美国ThermoFisher公司)，添加10ng/ml的bFGF配制而成。

步骤(3)角膜内皮样细胞的诱导：在transwell小室内(上室)接种B4G12细胞，培养板内(下室)接种皮肤前体细胞SKPs，加入B4G12细胞培养基共培养。

其中一个具体实施方式中，角膜内皮样细胞的诱导过程为：

10ug/ml层粘连蛋白及10mg/ml硫酸软骨素包被培养板，pbs冲洗。将SKPs用0.05％胰酶-0.02％EDTA消化后接种在包被好的培养板中，与B4G12细胞用transwell小室非接触式共培养，培养基为B4G12细胞培养基，即人内皮细胞无血清培养基HE-SFM添加10ng/ml的bFGF。诱导4天后部分细胞形态转变为多边形，随时间延长而逐渐增多，8天后多边形细胞占大多数，相互之间形成紧密连接呈单层镶嵌样排列，光学显微镜观察、免疫荧光、实时定量PCR、Western blotting证实诱导的细胞具有与人角膜细胞相似的形态及标记物的表达。诱导得到的角膜内皮样细胞7-10天传代，可稳定传3-4代，传代后仍能保持其形态及各标记物的表达。

上述方法获得的角膜内皮样细胞。

所述的角膜内皮样细胞具备角膜内皮细胞的一些特性：细胞呈多边形，细胞相互之间形成紧密连接层呈单层镶嵌样排列，表达角膜内皮主要标记物Na⁺/K⁺ATPase和ZO-1，较SKPs在多种角膜内皮相关标记物(Na⁺/K⁺ATPase、ZO-1、N-cadherin、CA2、Col4a2、Col8a2)表达上均有增高。

上述方法获得的角膜内皮样细胞在制备角膜移植物中的用途，其作为种子细胞使用。

一种角膜移植物，其包括上述方法获得的角膜内皮样细胞作为种子细胞。

一种组织工程化角膜后板层，其包括上述方法获得的角膜内皮样细胞和药学上可接受的生物可降解材料。

药学上可接受的生物可降解材料，如角膜脱细胞基质等。

本发明的主要优点在于：

本发明首次将人皮肤来源的前体细胞诱导分化为角膜内皮样细胞，为人角膜细胞修复提供的有效的实验依据，并且SKPs不表达HLA-DR，可抑制T淋巴细胞的增殖和激活，免疫原性和免疫反应性较弱，而且皮肤取材方便，来源广泛，可为角膜内皮细胞提供可靠充足的细胞来源。

本发明采用人皮肤来源的前体细胞与人角膜内皮细胞系(B4G12)共培养的诱导方式，不仅避免了提取原代人角膜内皮细胞的繁琐步骤和人角膜供体远远不能满足需求的问题，还避免了采用细胞因子及化学诱导剂所产生的细胞毒性问题，并且该方法较常规诱导方法具有更高的诱导分化效率。

本发明诱导方法简单易行，对种子细胞只经过一次诱导即可获得角膜内皮样细胞，没有其他的中间环节，较其他方法可以更有效、快速的产生角膜内皮样细胞，为建立角膜内皮细胞的工业化制备提供基础。

本发明诱导方式获得的角膜内皮样细胞更为接近人角膜内皮细胞，角膜内皮样细胞性能更为稳定；并且通过模型动物实验，角膜内皮样细胞可有效修复损伤角膜内皮。

附图说明

图1光学显微镜观察皮肤来源前体细胞SKPs细胞：SKPs从7天时开始形成，呈悬球状，2-3周增多，传代后仍保持其特性。

图2光学显微镜观察SKPs诱导分化为角膜内皮样细胞.A：诱导后4天开始部分出现多边形细胞；B：8天后多边形细胞占大多数，相互之间形成紧密连接呈单层镶嵌样排列；C、D：诱导所得的细胞表达角膜内皮标记物Na⁺/K⁺ATPase和ZO-1。

图3 RT-PCR检测角膜内皮样细胞结果，可见角膜内皮样细胞较SKPs在多种角膜内皮相关标记物表达上有不同程度的增高。

图4 Western blotting检测角膜内皮样细胞结果，可见角膜内皮样细胞Na⁺/K⁺ATPase，ZO-1较SKPs细胞表达上调。

图5光学显微镜观察角膜内皮样细胞传代培养：细胞仍保持单层多边形结构。

图6兔角膜内皮移植实验效果图，移植组术后角膜透明度逐渐提高，术后7天角膜几乎完全恢复透明。

图7角膜内皮移植术后角膜透明后处死角膜冰冻切面及荧光显微镜观察图，角膜后表面覆盖单层Dil染色的角膜内皮样细胞，A为角膜冰冻切面，B为荧光显微镜观察图。

具体实施方式

实施例1诱导人皮肤来源的前体细胞分化为角膜内皮样细胞

1、人皮肤来源的前体细胞SKPs的培养：

将皮肤组织用青霉素-链霉素冲洗消毒，剪成1mm×2mm的组织块，用Dispase酶4℃消化12-24h，将表皮去除得到真皮，胶原酶消化2-3h，用含胎牛血清的DMEM中和，将细胞解离后细胞筛网过滤，将细胞接种在培养瓶中，加入SKPs培养液，置于37℃，5％CO₂培养箱内培养。约2-3周，球形悬浮状SKPs形成，传至2-4代时用于诱导分化。SKPs细胞的培养观察结果见图1所示。

SKPs培养液为DMEM/F12＝3:1的基础培养基,添加2％B27,40ng/ml bFGF,20ng/ml EGF,1％青链双抗。

2、角膜内皮细胞B4G12的培养：

将装有细胞的冻存管从超低温冰箱取出，迅速转移至37℃水浴锅内将管内冰块溶解，将冻存管内细胞悬液移至15ml离心管内，加入1mlB4G12细胞培养基，1000转/分钟离心5分钟后弃上清，再加入3ml B4G12细胞培养基重悬细胞沉淀，最后将细胞加入用10ug/m层粘连蛋白及10mg/mL硫酸软骨素包被好的培养瓶内常规条件下培养，隔日换液。

所述的B4G12细胞培养基为人内皮细胞无血清培养基HE-SFM(购自美国ThermoFisher公司)，添加10ng/ml的bFGF配制而成。

3、角膜内皮样细胞的诱导

10ug/ml层粘连蛋白及10mg/ml硫酸软骨素包被培养板，pbs冲洗。将SKPs用0.05％胰酶-0.02％EDTA消化后接种在包被好的培养板中，与B4G12细胞用transwell小室非接触式共培养，培养基为B4G12细胞培养基，即人内皮细胞无血清培养基HE-SFM添加10ng/ml的bFGF。诱导得到的角膜内皮样细胞每7-10天用胰酶-EDTA消化后传代。

所述transwell小室(购自Corning，货号3450)，为0.4um孔径的镶嵌式小室，细胞不会由上室迁徙至下室，但允许细胞分泌的因子通过，从而诱导下室细胞分化，小室具有薄透明聚酯膜，在相差显微镜下提供下室极好的细胞可见性和细胞构造。

实施例2角膜内皮样细胞鉴定及角膜修复实验

诱导4天后部分细胞形态转变为多边形，随时间延长而逐渐增多，8天后多边形细胞占大多数，相互之间形成紧密连接呈单层镶嵌样排列，光学显微镜观察、免疫荧光、实时定量PCR、Western blotting证实诱导的细胞具有与人角膜细胞相似的形态及标记物的表达。角膜内皮样细胞可稳定传3-4代，传代后仍能保持其形态及各标记物的表达。SKPs诱导分化为角膜内皮样细胞的光学显微镜效果图参见图2所示。RT-PCR结果和Western blotting检测结果分别参见图3、图4。

兔角膜内皮移植实验:戊巴比妥钠静脉麻醉新西兰大白兔，常规消毒，倍诺喜表麻，无菌生理盐水冲洗结膜囊，球后注射利多卡因。在手术显微镜下做巩膜隧道，穿刺入前房，注入粘弹剂，刮除角膜内皮，将Dil标记的角膜内皮样细胞以3000个/mm²密度移植入入前房，关闭巩膜隧道。术后保持术眼向下体位6小时，典舒眼膏及氧氟沙星眼膏点眼。定期行裂隙灯、激光共聚焦显微镜、前节OCT等检查；定期处死，取下角膜行荧光显微镜、HE染色等检测。

动物实验示兔角膜由混浊程度逐渐减轻，角膜由厚变薄，移植术后7天角膜几乎完全恢复透明(效果参见图6)，后弹力层覆盖有单层紧密排列的多边形角膜内皮样细胞，可见红色荧光，表达Na+/K+ATPase，对照组角膜混浊水肿，后弹力层裸露没有内皮覆盖，无荧光细胞(结果参见图7)。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。