人皮肤来源的前体细胞诱导分化为角膜内皮样细胞的方法与流程

文档序号:12346259阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种诱导人皮肤来源的前体细胞分化为角膜内皮样细胞的方法,其特征在于,采用人皮肤来源的前体细胞与人角膜内皮细胞共培养,诱导人皮肤来源的前体细胞分化为角膜内皮样细胞。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,人角膜内皮细胞为人角膜内皮细胞B4G12细胞系。

3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,人皮肤来源的前体细胞与人角膜内皮细胞共培养方式为非接触式共培养;优选的,采用transwell小室非接触式共培养。

4.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述方法按照步骤:

(1)人皮肤来源的前体细胞SKPs的培养;

(2)角膜内皮细胞B4G12的培养;

(3)角膜内皮样细胞的诱导;

优选的,步骤(1)包括:将皮肤组织用青霉素-链霉素冲洗消毒,剪成1mm×2mm的组织块,用Dispase酶4℃消化12-24h,将表皮去除得到真皮,胶原酶消化2-3h,用含胎牛血清的DMEM中和,将细胞解离后细胞筛网过滤,将细胞接种在培养瓶中,加入SKPs培养液,置于37℃,5%CO2培养箱内培养,直至球形悬浮状SKPs形成,传代获得用于诱导分化的SKPs;

优选的,步骤(2)包括:将装有B4G12细胞的冻存管从超低温冰箱取出,迅速转移至37℃水浴锅内将管内冰块溶解,将冻存管内细胞悬液移至15ml离心管内,加入1ml B4G12细胞培养基,1000转/分钟离心5分钟后弃上清,再加入3ml B4G12细胞培养基重悬细胞沉淀,最后将细胞加入用10ug/m层粘连蛋白及10mg/ml硫酸软骨素包被好的培养瓶内常规条件下培养,隔日换液。

5.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,人皮肤来源的前体细胞与人角膜内皮细胞共培养过程为:在transwell小室内(上室)接种人角膜内皮细胞或B4G12细胞,培养板内(下室)接种皮肤前体细胞SKPs,培养基为人内皮细胞无血清培养基HE-SFM添加10ng/ml的bFGF配制而成。

6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,人皮肤来源的前体细胞与人角膜内皮细胞共培养过程为:10ug/ml层粘连蛋白及10mg/ml硫酸软骨素包被培养板,pbs冲洗;将SKPs用0.05%胰酶-0.02%EDTA消化后接种在包被好的培养板中,与B4G12细胞用transwell小室非接触式共培养;诱导得到的角膜内皮样细胞每7-10天用胰酶-EDTA消化后传代。

7.根据权利要求1-6任一项方法获得的角膜内皮样细胞。

8.权利要求7所述的角膜内皮样细胞,其特征在于,细胞呈多边形,细胞相互之间形成紧密连接层单层镶嵌样排列,表达角膜内皮标记物Na+/K+ATPase和ZO-1,较SKPs在角膜内皮相关标记物Na+/K+ATPase、ZO-1、N-cadherin、CA2、Col4a2、Col8a2表达上均有增高。

9.权利要求7或8所述的角膜内皮样细胞在制备角膜移植物中的用途,其作为种子细胞使用。

10.一种角膜移植物,其包括权利要求7或8所述的角膜内皮样细胞;或者,一种组织工程化角膜后板层,其包括权利要求7或8所述的角膜内皮样细胞和药学上可接受的生物可降解材料。

当前第2页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1