一种微载体的制备方法与流程

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种微载体的制备方法。

背景技术：

微载体细胞培养技术是将细胞接种于一定尺寸的微球上，在立体培养环境下实现对细胞的快速大量高质量的扩增，以便于组织工程需要及干细胞治疗。随着材料合成技术的进步，利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid，PLGA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)等无毒、生物相容性好的可降解高分子材料制备的微载体，在实现体外细胞大量扩增的同时，亦可装载细胞进行损伤组织修复，扩大了细胞微载体的应用范围。

目前常用的制备微载体方式有很多，如喷雾技术干燥法、双乳化法和微球烧结法等。Taek Kyoung Kim等利用复乳溶剂蒸发法制备内外开放多孔的微载体，并用于体外细胞扩增。Chen Wu等利用悬浮聚合结合冻干方式制备多孔壳聚糖微载体用于肝脏细胞的大规模培养。

近些年，随着微载体技术的不断发展，人们开始对传统微载体制备技术存在的一些问题展开研究。首先，微载体的尺寸形貌在大规模细胞培养中是一个关键的因素，然而目前常用的技术所制备的微载体尺寸往往分布极不规则，且形貌大小不可控。另外传统制备技术常常涉及溶剂去除过程，这一过程往往耗时较长，且残留的有机溶剂对细胞生长具有一定毒性作用。因此，近年来很多研究致力于解决传统微载体制备中存在的问题。

目前，用于制备PLGA、PLA等高分子聚合物微载体的主要方法是通过乳化溶剂蒸发法，同时通过调整搅拌转速的方式控制微载体直径大小。其缺点是：1)无法精确地控制微载体的形貌及尺寸，获得的微载体往往大小不一；2)采用溶剂挥发方式固型的方法，往往需要较长的时间去除有机溶剂，制备周期过长，生产效率较低，导致目前产品成本过高和价格昂贵；3)传统方式制备微载体常常使用二氯甲烷、氯仿等细胞毒性较大的有机溶剂，这些溶剂容易残留，对细胞具有一定毒性作用。所有这些缺点限制了微载体在体外细胞培养及组织修复方面的应用。

另外，目前商品化微载体之所以较为昂贵且一般仅用于实验，主要是传统制备技术无法实现快速连续的生产，传统微载体制备工艺通常产量较低且效率不高，无法满足市场用量的需求。因此，研发一种简单、高效、可控的微载体制备技术将会有很好的应用前景。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种微载体的制备方法。该微载体的制备方法简单、高效、大小形貌可控。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种微载体的制备方法，包括如下步骤：

将高分子聚合物溶于由DMSO与NMP组成的混合溶剂或纯NMP中，得到高分子聚合物溶液；

将高分子聚合物溶液置于设置有针头的推注装置中，利用高压静电场使高分子聚合物溶液带电，在针头末端形成液滴，形成的液滴滴入萃取溶剂中，通过溶剂萃取原理快速去除液滴中的有机溶剂，以此快速制备微载体。

本发明针对传统微载体制备技术存在的一些问题，通过高压静电滴注方式结合溶剂萃取原理，获得大小均一、尺寸和形貌可控的微载体，并使微载体快速连续生产成为可能。首先，应用NMP(N-甲基吡咯烷酮)、DMSO(二甲基亚砜)等低毒性极性剂溶解PLGA，由于此类溶剂与水或乙醇等溶液良好互溶，通过溶剂萃取原理，可以极大地缩短溶剂去除的时间，通过改变高分子聚合物溶液中NMP/DMSO和醇水溶液中成分的比例，可达到改变微载体形貌的效果。以针头、推注泵和静电发生器等构成的简单装置，通过调整电压大小和针头内径等参数可精确控制微载体的尺寸大小。这一技术可以实现简单、可控、高效的微载体制备并达到连续生产的目的。

本发明方法将高分子聚合物溶解到极性溶剂中制成高分子聚合物溶液，之后利用高压静电场使高分子聚合物溶液带电克服其表面张力在针头末端的泰勒锥表面高速喷射出粒径可控、单分散性好的聚合物液滴，液滴滴入水/乙醇溶液中，通过极性溶剂与水/乙醇互溶的方式萃取聚合物液滴中的极性溶剂，以达到微球快速固形的目的。

作为优选，高分子聚合物选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)或聚苯乙烯(PS)。

在本发明提供的一些实施例中，高分子聚合物为PLGA。

作为优选，混合溶剂中NMP的体积百分比为10％～100％。

优选地，混合溶剂中NMP的体积百分比为30％～90％。

更优选地，混合溶剂中NMP的体积百分比为30％～70％。

最优选地，混合溶剂中NMP的体积百分比为70％。

作为优选，以g/100mL计，高分子聚合物溶液中高分子聚合物的质量体积百分浓度为3％～9％。

优选地，以g/100mL计，高分子聚合物溶液中高分子聚合物的质量体积百分浓度为5％～7％。

在本发明提供的一些实施例中，以g/100mL计，高分子聚合物溶液中高分子聚合物的质量体积百分浓度为5％，混合溶剂中NMP的体积百分比为30％～90％。优选混合溶剂中NMP的体积百分比为30％～70％。

在本发明提供的一些实施例中，以g/100mL计，高分子聚合物溶液中高分子聚合物的质量体积百分浓度为7％，混合溶剂中NMP的体积百分比为70％～100％。优选混合溶剂中NMP的体积百分比为70％～90％。

在本发明中，高压静电场由高压静电发生器产生。

作为优选，高压静电场的电压强度不超过11kv。在相同针头内径条件下，随着电压强度增大，微载体尺寸减小。

作为优选，针头的内径为0.16～0.92mm。在相同电压强度条件下随着针头内径直径的增大，微载体尺寸随之变大。

作为优选，萃取溶剂为乙醇、水或乙醇水溶液中的一种。

在本发明提供的一些实施例中，乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为0％～100％之间。

在本发明提供的一些实施例中，高分子聚合物溶液中高分子聚合物的质量体积百分浓度为5％，乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为72％～100％之间，微载体为不规则形；乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为50.1％～72％之间，微载体为蝌蚪形；乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为16.6％～50.1％之间，微载体为球形；乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为0～16.6％之间，微载体为片状。

在本发明提供的一些实施例中，高分子聚合物溶液中高分子聚合物的质量体积百分浓度为7％，乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为74.3％～100％之间，微载体为不规则形；乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为57.1％～74.3％之间，微载体为蝌蚪形；乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为9％～57.1％之间，微载体为球形；乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为0～9％之间，微载体为片状。

在本发明中，液滴滴入萃取溶剂中之后还包括清洗、真空干燥的步骤。

本发明还提供了一种细胞培养方法，将细胞接种于本发明制备方法制得的微载体表面进行细胞培养。

本发明提供了一种微载体的制备方法。该微载体的制备方法包括：将高分子聚合物溶于由DMSO与NMP组成的混合溶剂或NMP中，得到高分子聚合物溶液；将高分子聚合物溶液置于设置有针头的推注装置中，利用高压静电场使高分子聚合物溶液带电，在针头末端形成液滴，液滴滴入萃取溶剂中，通过溶剂萃取原理快速去除液滴中的有机溶剂，以此快速制备微载体。本发明至少具有如下优势之一：

1、本发明制备方法缩短了制备微载体过程的时间，具有方法简单、高效的特点；

2、本发明制备方法可连续可控生产粒径均匀的高分子聚合物微载体，并且达到了精确调控微载体尺寸及形貌的目的；

3、本发明制备方法所需装置简单，包括针头、推注装置和静电发生器。

附图说明

图1示通过静电滴注方式及溶剂置换原理制备内部多孔结构PLGA微载体原理图；

图2示不同PLGA浓度、溶剂(NMP、DMSO)成分条件下制备PLGA微载体的光镜照片；其中，2-1示采用NMP：DMSO＝10:0的溶剂溶解PLGA后制得的PLGA浓度为5％的微载体；2-2示采用NMP：DMSO＝9:1的溶剂溶解PLGA后制得的PLGA浓度为5％的微载体；2-3示采用NMP：DMSO＝7:3的溶剂溶解PLGA后制得的PLGA浓度为5％的微载体；2-4示采用NMP：DMSO＝5:5的溶剂溶解PLGA后制得的PLGA浓度为5％的微载体；2-5示采用NMP：DMSO＝3:7的溶剂溶解PLGA后制得的PLGA浓度为7％的微载体；2-6示采用NMP：DMSO＝10:0的溶剂溶解PLGA后制得的PLGA浓度为7％的微载体；2-7示采用NMP：DMSO＝9:1的溶剂溶解PLGA后制得的PLGA浓度为7％的微载体；2-8示采用NMP：DMSO＝7:3的溶剂溶解PLGA后制得的PLGA浓度为7％的微载体；

图3示不同成分(乙醇：水)置换溶液对PLGA微载体形貌的影响(溶剂：NMP:DMSO＝7:3)；其中，乙醇水溶液中乙醇体积百分比具体为：A：100-81.3％，B：81.3-72％，C：72-62.5％，D：62.5-50.1％，E：50.1-16.6％，F：16.6-0％，G：100-83.2％，H：83.2-74.3％，I：74.3-66.2％，J：66.2-57.1％，K：57.1-9％，L：9-0％；

图4示PLGA微载体表面形貌及内部结构的电镜照片；其中，4-1示PLGA微载体表面形貌电镜照片；4-2示PLGA微载体内部结构的电镜照片；

图5、6示不同电压强度对微载体粒径尺寸的影响(针头内径:0.25mm)；其中，图5为微载体粒径随电压强度增大的变化曲线，图6-1～6-8分别示电压强度为0、2.5、5、6、7.5、9、11、＞11kv条件下制备的微载体电镜图；

图7、8示不同内径针头对微载体粒径尺寸的影响(电压强度:5kv)；其中，图7为微载体粒径随针头内径增大的变化曲线，图8-1～8-7分别示针头内径为0.92、0.61、0.42、0.31、0.25、0.18、0.16mm条件下制备的微载体电镜图；

图9示实施例2制备的球形PLGA微载体；

图10示实施例3制备的不规则形PLGA微载体；

图11示实施例4制备的蝌蚪形PLGA微载体；

图12示不同形貌微载体对细胞增殖的影响。

具体实施方式

本发明公开了一种微载体的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的微载体的制备方法中所用原料、辅料或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1不同制备参数对微载体的影响

1、PLGA微载体的制备方法

本方法利用DMSO、NMP等高极性溶剂溶解PLGA制PLGA溶液，之后利用高压静电场使PLGA溶液带电克服其表面张力，在喷头末端的泰勒锥表面高速喷射出粒径可控、单分散性好的PLGA液滴，液滴进入置换溶液(水/乙醇混合物)中，通过极性溶剂与水/乙醇互溶液互溶的原理萃取出PLGA液滴中的有机溶剂，以达微载体快速固形的目的。具体方法如下：利用DMSO、NMP混合溶剂(NMP:DMSO＝10∶0～0∶10)溶解PLGA制成PLGA溶液(PLGA浓度：5％、7％)，将PLGA溶液通过针头以静电滴注的方式滴加到置换溶液中(水:乙醇＝10:0～0:10)，通过收集装置中的管道进行收集。用将制备完成的PLGA微载体分别用水与乙醇溶液反复清洗三遍，真空干燥备用。制备方法流程如图1所示。

2、参数控制及微载体表征

分别改变PLGA微载体制备中的不同参数，参数包括：

参数1：有机溶剂比例，NMP:DMSO＝10:0～0:10；

参数2：置换溶液比例，水：乙醇＝10:0～0:10；

参数3：PLGA浓度5％、7％；

参数4：电压强度，0-15KV；

参数5：针头内径，0.16～0.92mm。

按上述制备流程制备PLGA微载体，并通过电镜及光镜观察、微载体粒径分析观察不同参数对PLGA微载体制备的影响。

(1)PLGA浓度和有机溶剂比例对PLGA微载体的影响

参数1：有机溶剂比例，NMP:DMSO＝10:0、9:1、7:3、5:5、3:7、1:9；

参数2：置换溶液比例，水：乙醇＝6:4；

参数3：PLGA浓度5％、7％；

参数4：电压强度，6KV；

参数5：针头内径，0.18mm。

试验结果见表1、图2。

表1PLGA浓度、有机溶剂(NMP、DMSO)成分对微载体粒径及PLGA溶解状态的影响。(置换溶液：乙醇：水＝6:4)

结果如表1所示和图2所示，溶剂及PLGA浓度对微载体的制备有很大影响。当溶剂中DMSO比例大于一定范围后，无法完全溶解PLGA。随着溶剂中NMP的比例增高，PLGA被完全溶解，但溶剂中NMP含量过大时，所制备的微球粒径较小且形貌极不规则，不适用于细胞培养，另外当PLGA浓度较小时(5％)，使用纯NMP作为溶剂无法制备出微载体，其会在置换溶液内形成一层微粒构成的薄膜(图2所示)。通过图2及表1可知，在相同制备条件下，微载体的尺寸随着PLGA的浓度上升而增加，同时微载体的尺寸与溶剂中NMP比例成反比。可见，当PLGA浓度为5％时，NMP:DMSO＝7:3～3:7范围内制备的微载体形貌规则，粒径为422.6～550.6μm之间；当PLGA浓度为7％时，NMP:DMSO＝9:1～7:3范围内制备的微载体形貌规则，粒径为456.8～500.1μm之间。

(2)PLGA浓度和置换溶剂比例对PLGA微载体的影响

参数1：有机溶剂比例，NMP:DMSO＝7:3；

参数2：置换溶液比例，水：乙醇＝10:0～0:10；乙醇体积百分比具体为：A：100-81.3％，B：81.3-72％，C：72-62.5％，D：62.5-50.1％，E：50.1-16.6％，F：16.6-0％，G：100-83.2％，H：83.2-74.3％，I：74.3-66.2％，J：66.2-57.1％，K：57.1-9％，L：9-0％；

参数3：PLGA浓度5％、7％；

参数4：电压强度，6KV；

参数5：针头内径，0.18mm。

试验结果见图3。

由图3可知，当置换溶液中乙醇与水的成分比例改变时，微载体的形貌会发生变化，随着置换溶液中乙醇的成分不断减少，其形貌会形成一个由不规则形态—蝌蚪形—球形—片状的变化规律。当PLGA浓度为5％时，微载体保持球形的置换溶剂条件为乙醇浓度50.1-16.6％；当PLGA浓度增加到7％时，微载体成球的乙醇浓度为57.1-9％，其成球置换溶剂浓度区间较为增宽。

(3)PLGA微载体表面形貌及内部结构

通过(1)和(2)试验中PLGA浓度、有机溶剂比例、置换溶液比例对PLGA微载体的影响得出的优化制备条件制备PLGA微载体，并切开利用电镜观察其表面形貌及内部结构，图4显示PLGA微载体具有较为光滑的表面结构，其内部为贯通多孔结构。

(4)电压强度对PLGA微载体的影响

参数1：有机溶剂比例，NMP:DMSO＝7:3；

参数2：置换溶液比例，水：乙醇＝6:4；

参数3：PLGA浓度5％；

参数4：电压强度，0-15KV；具体为0、2.5、5、6、7.5、9、11、＞11kv；

参数5：针头内径0.18mm。

试验结果见图5、图6。

由图5、6可知，通过改变电压强度可较为准确的控制微载体的尺寸大小，在相同尺寸针头内径条件下随着电压强度的增大微载体的尺寸随之减小，但当电压超过11kv后微载体的均匀性无法继续保持。

(5)针头尺寸对PLGA微载体的影响

参数1：有机溶剂比例，NMP:DMSO＝7:3；

参数2：置换溶液比例，水：乙醇＝6:4；

参数3：PLGA浓度5％；

参数4：电压强度，6KV；

参数5：针头内径，0.16～0.92mm；具体为0.92、0.61、0.42、0.31、0.25、0.18、0.16mm。

试验结果见图7、8。

由图7、8可知，通过改变针头尺寸可较为准确的控制微载体的尺寸大小，在相同电压强度条件下随着针头内径直径的增大微载体尺寸随之变大。

通过实验(4)、(5)可知，通过改变针头尺寸及电压强度可较为准确的控制微载体的尺寸大小，在相同尺寸针头内径条件下随着电压强度的增大微载体的尺寸随之减小，但当电压超过11kv后微载体的均匀性无法继续保持。在相同电压强度条件下随着针头内径直径的增大微载体尺寸随之变大。

实施例2PLGA微载体的制备

利用DMSO、NMP混合溶剂(NMP:DMSO＝7:3)溶解PLGA制成浓度为5％PLGA溶液，将PLGA溶液通过针头以静电滴注的方式(电压强度5kv，针头内径为0.25mm)滴加到置换溶液中，置换溶液为乙醇水溶液(水:乙醇＝1:1)，通过收集装置中的管道进行收集。将制备完成的PLGA微载体分别用水与乙醇溶液反复清洗三遍，真空干燥备用。电镜下观察制得的微载体呈规则的球形(图9)，表面形貌光滑。

实施例3PLGA微载体的制备

利用DMSO、NMP混合溶剂(NMP:DMSO＝7:3)溶解PLGA制成浓度为5％PLGA溶液，将PLGA溶液通过针头以静电滴注的方式(电压强度5kv，针头内径为0.25mm)滴加到置换溶液中，置换溶液为乙醇水溶液(水:乙醇＝3:7)，通过收集装置中的管道进行收集。将制备完成的PLGA微载体分别用水与乙醇溶液反复清洗三遍，真空干燥备用。电镜下观察制得的微载体呈蝌蚪形(图10)。

实施例4PLGA微载体的制备

利用DMSO、NMP混合溶剂(NMP:DMSO＝7:3)溶解PLGA制成浓度为5％PLGA溶液，将PLGA溶液通过针头以静电滴注的方式(电压强度5kv，针头内径为0.25mm)滴加到置换溶液中，置换溶液为乙醇水溶液(水:乙醇＝1:4)，通过收集装置中的管道进行收集。将制备完成的PLGA微载体分别用水与乙醇溶液反复清洗三遍，真空干燥备用。电镜下观察制得的微载体呈不规则形(图11)。

实施例5采用制得的微载体进行细胞培养

将MC3T3-E1细胞接种到球形(实施例2)、蝌蚪形(实施例3)和不规则形(实施例4)三种不同形貌微载体表面，通过细胞反应器进行培养，利用MTT法定期监测细胞增殖情况。结果见图12。

结果显示：通过细胞培养实验发现不同形貌的微载体对细胞增殖会产生不同的影响，表面不规则形貌的微载体更利于细胞增殖，这可能和表面粗糙程度增加及微载体比表面积的增加有关。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。