本发明涉及一种提高水酶法提取山茶籽油产率的方法，尤其是一种在水酶法提取山茶籽油过程中，通过利用含钙化合物沉淀茶皂素，减少乳化物形成，从而提高清油率的方法。
(二)
背景技术：
山茶(学名：Camellia japonica L.)是我国特有的木本油料树种，也是世界四大木本油料树种之一。山茶籽作为山茶的副产物，其富含油脂(40～50％)、茶皂素(10％～20％)、蛋白质(10％)等活性物质，用其所制得的山茶籽油富含不饱和脂肪酸和人体所必须的氨基酸以及锌、硒等微量元素，是深受广大消费者喜爱的高档食用油，具有广阔的市场发展潜力。茶皂素，属齐墩果烷型五环三萜类化合物，是由疏水皂甙元(即配基)、糖体和有机酸形成的结构复杂的化合物；是一种天然非离子型表面活性剂，具有乳化、起泡等性能，在食品、日化、医学等领域广泛应用。
目前，常见的山茶籽提油方法包括有机溶剂浸提法、物理压榨法和水酶法。水酶法提油工艺是油料破碎后通过添加合适的生物酶，进行酶解，使油脂易于从油料中释放出，利用非油成分(蛋白质和碳水化合物)对油和水亲和力的差异及油水密度的不同将油与非油成分分离。CN101235399主要介绍了利用0.04％酸性蛋白酶/纤维素酶(1：1)混合酶酶解4h，并采用离心破乳法破乳，最终净油率可达24.67％。较其它两种方法，水酶法提油工艺具有能耗低、设备简单、油脂品质好、无化学污染等优点，是一种很有应用前景的提油新技术，但由于在制油过程中游离油脂不断与皂素、蛋白质、糖类等物质接触，在介于油层和水相间会形成一层较稳定的白色乳状物质，从而严重影响到游离油较好的分离(清油得率低)，这是制约该工艺推广应用的“瓶颈”。如何提高提油率，减少乳化物的形成，是亟带解决的重要难题。
目前报道，提高水酶法提取山茶籽油产率的方法基本从后续破乳方面着手，主要有三类：即以冷冻解冻、静置等为主的物理法破乳；以有机溶剂(乙醇)为主的化学方法；以生物酶法为主的生物破乳法。CN102154059A介绍采用了醇法破乳，该发明操作简单，破乳率高，但是食品中会有化学有机试剂残留影响食品安全且提高了生产成本。CN104440174A公开了一种微波处理破乳法，虽然未使用有机试剂，但是微波处理使油脂的品质下降(酸价和过氧化值均上升)，且破乳效果不佳，影响了该方法的推广应用。
(三)
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种提高水酶法提取山茶籽油产率的方法，通过利用含钙化合物选择性沉淀、分离茶皂素，降低其与油脂形成乳化物的机会，提高清油释放，从而提高清油率。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高水酶法提取山茶籽油产率的方法，所述的方法包括如下步骤：
(1)将山茶籽粉末(40目)与水(优选蒸馏水)按料液质量比1：1～10混合，升温至80～90℃灭酶5～10min，(用0.1mol/L NaOH溶液)调节pH值为4.5～6.0，得到混合液；
(2)在步骤(1)所得混合液中添加含钙化合物并进行水酶法提油；
所述水酶法提油的操作方法为：在步骤(1)所得混合液中添加纤维素酶，50～60℃酶解0.5～2h，然后(用2mol/L NaOH溶液)调节pH值为8.0～9.5，再添加Alcalase 2.4L碱性蛋白酶，55～70℃酶解2～5h，之后升温至80～90℃灭酶5～10min，冷却至室温(20～30℃)，离心(8000rpm、30min、4℃)，收集上层清油进行产率的计算；
所述纤维素酶的酶活10000U/g，所述纤维素酶的添加质量以所述混合液的体积计为0.1～0.15g/100mL；所述Alcalase 2.4L碱性蛋白酶的酶活2.4AU/g，所述Alcalase 2.4L碱性蛋白酶的添加体积量以所述混合液的体积计为0.1～0.15mL/100mL；
所述含钙化合物的添加时间需在添加纤维素酶酶解反应开始后，并保证在设定的以Alcalase 2.4L碱性蛋白酶酶解反应结束前1h加入；
所述含钙化合物为氯化钙、氧化钙或碳酸钙；所述的氯化钙、氧化钙均以溶液形式添加，优选以0.1～0.5mol/L的溶液形式添加，且添加方式优选流加法(即以1～2mL/h的速率连续流加)；特别优选以流加法的方式添加0.1mol/L氯化钙溶液；所述的碳酸钙以固体形式添加；
所述含钙化合物以钙计的添加量基于山茶籽粉末中茶皂素的含量进行计算，所述含钙化合物以钙计与茶皂素的理论物质的量之比为1：0.2～3，优选1：1～3；
所述山茶籽粉末中茶皂素的含量可按照本领域公知的香草醛-硫酸显色法测定。
本发明的有益效果主要体现在：在乳化物形成前，通过三萜苷类物质(皂素)水溶液可以和钙盐发生反应产生沉淀这一性质，沉淀皂素，减少油脂与其作用产生乳化现象，从而提高游离油脂的得率，具有低能耗、无污染、绿色健康、操作简单等优点。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的说明和描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
下列实施例中，清油率采用获取清油质量与总茶籽样品中油脂质量百分比计算，即清油率＝清油质量/样品中油脂总质量×100％；乳化物与总样品之比＝乳化物质量/样品总质量×100％。
下列实施例中Ca2+的添加量是基于山茶籽中皂素含量进行计算，其中山茶籽中皂素含量用香草醛-硫酸显色法测得，即根据测得标准液所得标准曲线方程：y＝23.64x-0.058R2＝0.9973，计算得山茶籽中茶皂素含量为：16.09％±1.10。
下列实施例中，用到的纤维素酶、Alcalase 2.4L碱性蛋白酶的来源信息如下：
纤维素酶：购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；产品货号：C109262-100g，产品规格：粉末，10000U/g；
Alcalase 2.4L碱性蛋白酶：购买于诺维信(中国)生物技术有限公司；产品规格：2.4AU/g。
对比例1
取5克茶籽粉末(40目)于100ml烧杯中，以料液比1：8添加蒸馏水，在90℃水浴中灭酶10min，0.1mol/L NaOH溶液调节pH至6.0，添加0.1％(w/v，g/mL)纤维素酶，50℃酶解1h，再用2mol/L NaOH溶液调节pH至9.0，添加0.1％(v/v，mL/mL)Alcalase 2.4L碱性蛋白酶，60℃酶解4h。酶解结束后于90℃水浴中灭酶10min；冷却至室温，样液离心(8000rpm、30min、4℃)，收集上层清油和中间层乳化物，计算清油率及乳化物与总样品之比。结果列于表1。
实施例2-4：钙化合物种类对提油率及乳化物与总样品之比的影响
取5克茶籽粉末(40目)于100ml烧杯中，以料液比1：8添加蒸馏水，在90℃水浴中灭酶10min，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至6.0，添加0.1％(w/v，g/mL)纤维素酶，50℃酶解1h，再用2mol/L NaOH溶液调节pH至9.0，分别添加以nCa2+：n皂素＝1：1的含钙化合物(含钙化合物种类包括氯化钙、碳酸钙或氧化钙)，以及0.1％(v/v，mL/mL)Alcalase 2.4L碱性蛋白酶，60℃酶解4h。酶解结束后于90℃水浴中灭酶10min；冷却至室温，样液离心(8000rpm、30min、4℃)，收集上层清油和中间层乳化物，计算清油率及乳化物与总样品之比。结果列于表1。
表1常规水酶法、添加不同含钙化合物所得提油率及乳化物与总样品之比
由表1数据显示，实施例2所得清油明显高于其他，乳化物形成减少。由于随着反应进行，样品中皂素与Ca2+充分反应生成皂素钙沉淀，且氯化钙溶液与体系中蛋白质产生盐溶作用，溶解了部分蛋白质，从而减少了皂素、蛋白质与油脂的作用所形成的乳化物，提高游离油脂释放率；而实施例3由于添加的CaO在水溶液中溶解呈碱性，从而影响了纤维素酶酶解活力，降低了油脂的释放；实施例4添加的CaCO3在水中不溶解，皂素无法沉淀析出，因此提油率及乳化物与总样品之比与对比例相当。
实施例5-8：Ca2+添加量对提油率及乳化物与总样品之比的影响
取5克茶籽粉末(40目)于100ml烧杯中，以料液比1：8添加蒸馏水，在90℃水浴中灭酶10min，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至6.0，添加0.1％(w/v，g/mL)纤维素酶，50℃酶解1h，再用2mol/L NaOH溶液调节pH至9.0，分别添加nCa2+:n皂素＝1:3；1:2；2.5:1；5:1的0.1mol/L氯化钙，以及0.1％(v/v，mL/mL)Alcalase 2.4L碱性蛋白酶，60℃酶解4h，酶解结束后于90℃水浴中灭酶10min；冷却至室温，样液离心(8000rpm、30min、4℃)，收集上层清油和中间层乳化物，计算清油率及乳化物与总样品之比。结果列于表2。
表2 Ca2+添加量对提油率及乳化物与总样品之比的影响
在选用氯化钙作为沉淀剂的基础上，探讨了不同Ca2+添加量对水酶法提取山茶油清油率及乳化物与总样品之比的影响。由表2及实施例2可知，随着Ca2+添加量的增加，清油率呈先增加后减少的趋势。当nCa2+:n皂素之比为1:2时，恰好反应完全，此时所得最终提油率最高达79.69％，乳化物与总样品之比最低为16.27％。
实施例9-12：Ca2+与皂素反应时间对提油率及乳化物与总样品之比的影响
取5克茶籽粉末(40目)于100ml烧杯中，以料液比1：8添加蒸馏水，在90℃水浴中灭酶10min，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH6.0，添加0.1％(w/v，g/mL)纤维素酶，50℃酶解1h，再用2mol/L NaOH溶液调节pH至9.0，添加0.1％(v/v，mL/mL)Alcalase 2.4L碱性蛋白酶，60℃酶解4h进行提取，分别在酶解反应开始0h、1h、2h、3h、4h后添加nCa2+:n皂素＝1:2的0.1mol/L氯化钙(计为Ca2+与皂素反应时间5h、4h、3h、2h、1h)。酶解结束后于90℃水浴中灭酶10min；冷却至室温，样液离心(8000rpm、30min、4℃)，收集上层清油和中间层乳化物，计算清油率及乳化物与总样品之比。结果列于表3。
表3 Ca2+与皂素作用时间对提油率及乳化物与总样品之比的影响
由表3及表2中实施例6可知，提油率随着Ca2+与皂素作用时间的延长而增大。由于随着反应的进行，皂素与Ca2+不断以沉淀形式析出。反应时间越长，皂素与Ca2+的结合越彻底，皂素与游离脂肪的作用机会越少，形成乳化物越少。由此在本发明中，Ca2+与皂素反应时间5h时，提油率最高80.28％；乳化物与总样品之比降低至16.13％.
实施例13-14：氯化钙溶液添加方式对提油率及乳化物与总样品之比的影响
取5克茶籽粉末(40目)于100ml烧杯中，以料液比1：8添加蒸馏水，在90℃水浴中灭酶10min，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至6.0，添加Ca2+的总摩尔数相同，按不同方式添加nCa2+:n皂素＝1:2的氯化钙(分段添加0.1mol/L氯化钙、以1.344ml/h的流速流加0.05mol/L氯化钙)，以及0.1％(w/v，g/mL)纤维素酶，50℃酶解1h，再用2mol/L NaOH溶液调节pH至9.0，添加0.1％(v/v，mL/mL)Alcalase 2.4L碱性蛋白酶，60℃酶解4h。酶解结束后于90℃水浴中灭酶10min；冷却至室温，样液离心(8000rpm、30min、4℃)，收集上层清油和中间层乳化物，计算清油率及乳化物与总样品之比。结果列于表4。
表4添加方式对提油率及乳化物占总样品比例的影响
在水酶法提油过程中，由于皂素在水相中的溶解度一定。本发明保证最佳Ca2+摩尔数的同时，采用一次添加法、分段添加法及流加法三种方法添加氯化钙溶液，研究添加方法对提油率及乳化物占总样品比例的影响。结果由表4及实施例6可得，以1.344ml/h的速率流加，效果最佳，其提油率可达90.17％；乳化物与总样品之比为8.38％。因为根据皂素在水溶液中溶解度大小，通过流加法逐滴加氯化钙溶液，确保滴加的Ca2+与游离皂素反应形成皂素钙沉淀，使皂素在水溶液中的浓度降低而不断地溶出，从而达到Ca2+与皂素结合更加高效、除游离皂素更彻底及添加的Ca2+无损失。