本发明涉及一种人胰岛素或其类似物的酰化衍生物的制备方法。
背景技术：
糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一种常见的代谢内分泌疾病，是由于体内胰岛素绝对或相对缺乏，或靶组织对胰岛素不敏感而引起的慢性高血糖为特征的伴随糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱的临床慢性、全身性代谢综合症。它由遗传和环境因素相互作用而引起，涉及人体各个系统，包括心脑血管、肾、眼、神经等脏器并发症，严重危害人类健康，是一种终生疾病。
糖尿病已成为一种常见病、多发病，是继癌症、心脑血管病之后，第三大威胁人类生命的疾病，是全人类的挑战，其对人们生命健康的危害不分种族和国家。据国际糖尿病联盟(IDF)的统计，上个世纪八十年代中期至九十年代中期十年间，糖尿病患者总量增长4倍，达到1.2亿。2007年全球糖尿病患者人数为2.46亿，其中46％为40-59岁劳动力人口。预计到2025年全世界糖尿病患者将增加到3.8亿，占到世界成年人口的7.1％。
使用人胰岛素是治疗糖尿病的一种主要方法，但是人胰岛素作用时间较短，使得病人必须频繁注射，极为不便。因此，人们致力于获得一些能够更长时间作用于人体的胰岛素类似物及其衍生物。其中，使用酰化基团修饰人胰岛素或其类似物，是一种提高其半衰期的有效方法。WO2005012347和WO2013086927分别公开了两类不同的人胰岛素类似物的酰化衍生物，此类衍生物是通过将脂肪酸形式的酰化基团共价连接到人胰岛素类似物的氨基酸上，经过此种修饰后，它们的半衰期相对于现有的胰岛素类似物大大提高。
在WO2005012347和WO2013086927中，还公开了此种人胰岛素类似物的酰化衍生物的制备方法，该方法将以带羧酸保护基的脂肪酸与人胰岛素类似物反应，在生成以羧酸保护形式存在的酰化衍生物后，再经水解得到酰化基团以脂肪酸的形式存在的酰化衍生物，即该方法在形成最终所需的酰化衍生物时需要两步反应。由于在人胰岛素类似物的酰化衍生物的制备过程中，胰岛素类似物占据了大部分成本，其参与反应的步骤越多，就可能造成与其相关的收率下降，导致其最终产物的制备不经济；该两步反应还带来了较多的杂质，使得纯化变得非常困难。因此，迫切需要提供一种新的制备方法，以更为经济的条件来得到人胰岛素类似物的酰化衍生物，且提纯更加方便容易。
技术实现要素：
本发明的目的是为了提供一种新的人胰岛素或其类似物的酰化衍生物的制备方法。
本发明提供的制备方法是通过将脂肪酸直接与人胰岛素或其类似物反应，生成所需的人胰岛素或其类似物的酰化衍生物。所述的直接与人胰岛素或其类似物反应，指的是该脂肪酸的羧酸基团不被保护基保护的情况下，直接投入反应。
通过本发明所述的方法制备的人胰岛素或其类似物的酰化衍生物具有如下通式如示的结构：
S-W-X-Y-Z
其中S为人胰岛素或其类似物；
-W-X-Y-Z为胰岛素类似物的酰化修饰基团，其中W为：
●具有-OC(CH2)nCO-的二酰基结构，其中n为2～10之间整数，该结构以其酰基之一和母体胰岛素或其类似物的A-链或B-链N-末端氨基酸残基的α-氨基或B-链上存在的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键；
●侧链上带有羧基的α-氨基酸残基或含有侧链上带有羧基的α-氨基酸组成的2-4肽，其中该残基或肽与母体胰岛素或其类似物的A-链或B-链N-末端氨基酸残基的α-氨基或B-链上存在的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键连接；
X为：
●-CO-；
●含羧酸基团的二氨基化合物，该化合物以其氨基之一与W中的羧基形成酰胺键连接；
a)当W为氨基酸残基或2-4肽时，上述X基团通过-CO-与W上的氨基形成酰胺键，或
b)当W为二酰基结构时，上述X基团以其氨基基团之一与二酰基结构连接；
Y为：
●-A(CH2)m-，其中m为6-32的整数，A为不存在或CO-；
●酰基二价烃链，其中含有1、2或3个-CH＝CH-基团和足以在链上获得10-32个碳原子总数的-CH2-基团；
●通式-B(CH2)vC6H4(CH2)w-的二价烃链，其中v和w为整数或其中一为0，使得v与w之后在6-30的范围，B为不存在或CO-；
a)当X为CO-时A或B为不存在，或
b)当X为二氨基化合物时A或B为CO-；
Z为-COOH。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的S-W-X-Y-Z中，W为在侧链上带有羧酸基团的α-氨基酸残基，该氨基酸为γ-Glu，该残基以其羧酸基团之一和人胰岛素或其类似物的B链N-末端氨基酸残基的α-氨基或者人胰岛素或其类似物B链上存在的Lys残基的ε-氨基一起形成酰胺键；X为-CO-；Y为-(CH2)m-，其中m为6-16的整数；且Z为-COOH。
在本发明另一个优选的实施方案中，所述的S-W-X-Y-Z中，W为具有-OC(CH2)nCO-的二酰基结构，其中n为2～10之间整数，该结构以其酰基之一和母体胰岛素或其类似物的A-链或B-链N-末端氨基酸残基的α-氨基或B-链上存在的Lys残基的ε-氨基形成酰胺键；X为含羧酸基团的二氨基化合物，该化合物以其氨基之一与W的一个酰基相连接；Y为-CO(CH2)m-，其中m为6-32的整数，Z为-COOH。当X为含羧酸基团的二氨基化合物时，其结构可以是-HN(COOH)C(CH2)pNH-，其中p为2-10的整数，优选2-6的整数，特别优选2-4的整数。
在本发明特别优选的实施方案中，所述的S-W-X-Y-Z中，-W-X-Y-Z具有选自如下的式(I)或式(II)所示的结构：
本发明所述的制备通式为S-W-X-Y-Z的人胰岛素或其类似物的酰化衍生物的方法，包括如下所示的式(III)所示的化合物和S代表的人胰岛素或其类似物反应的步骤，其中S、W、X、Y、Z的定义如前所述，
R-W-X-Y-Z
(III)
其中R为离去基团，优选活化酯基团，更优选选自
本发明所述的制备方法，除前述式(III)化合物与S反应的步骤外，还可包括式(III’)化合物脱除羧基保护基得到式(III)化合物的步骤，
其中，W’、X’、Z’分别代表W、X、Z中所有的羧基被保护基保护的形式，所述的保护基优选C1-C6的烷基，优选C1-C4的烷基，特别优选甲基或特丁基；R如式(III)化合物中定义。
在此之前，式(III’)化合物的制备方法可参考WO2005012347和WO2013086927中的公开的方法。
本发明所需制备的人胰岛素或其类似物的酰化衍生物中，所述的人胰岛素类似物种类没有特别限制。
在本发明优选的实施方案中，所述的人胰岛素类似物，具有如下所示的氨基酸序列的人胰岛素类似物：
其中，A0可以是R，也可以缺失；A21可以是N或G；
B3可以是K、D或N；
B27可以是E、T、D或K；
B28可以是E、D、P或K；
B29可以是E、K或P；
B30可以是K、R、E、T或者缺失；
B31、B32可以是R或者单个缺失或两者缺失，
其中当所述的A0缺失，A21是N，B3是N时：B31B32缺失，B27B28B29B30不是TPKT、TKPT或TDKT；
又或者当A0缺失，A21是N，B3是K，B31B32缺失时，B27B28B29B30不是TEKT；
又或者当A0缺失，A21是G，B3是N时，B27B28B29B30B31B32不是TPKTRR。
优选地，其中B29是赖氨酸(K)残基。
当A链的A0缺失，B链的B3是N时：优选的B28是E或D，B29是E、K或P，B30是R、E或者缺失，B31、B32缺失；更优选的当B30B31B32缺失时，B28B29是KE。
当B链的B3是D时：优选的B28、B29是P或K，B30是T或者缺失，B31、B32是R或者缺失；更优选的B28B29是PK。
当A链的A0缺失，B链的B3是K时：优选的B28、B29是P或E，B30是E或R，B31是R或者缺失，B32缺失；更优选的B28B29是PE。
本发明优选的实施方式中，所述人胰岛素类似物具有选自，但不限于如下所述的序列：
在本发明特别优选的人胰岛素类似物的酰化衍生物中，所述人胰岛素类似物选自B(1-27)-D-K-E,A(1-21)人胰岛素或B(1-29)，A(1-21)人胰岛素，B(1-29)，A(1-21)人胰岛素即为WO2005012347中所指的DES(B30)人胰岛素。
本发明人胰岛素类似物的酰化衍生物又一优选例，其中酰化修饰基团-W-X-Y-Z与母体胰岛素B3、B27-B30的赖氨酸(K)残基的ε-氨基连接。
本发明人胰岛素类似物的酰化衍生物又一优选例，其中酰化修饰基团-W-X-Y-Z与母体胰岛素A和B-链N-末端α-氨基连接。
本发明中最为优选的人胰岛素类似物的酰化衍生物选自以下任意一种：B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)des(B30)人胰岛素。
其中，B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素的结构式如下式的式IV，根据式IV的结构可以很容易地理解NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)des(B30)所代表的结构：
本发明另一方面还提供了一种式(III)所示的化合物，其中W、X、Y、Z的定义如前所述，
R-W-X-Y-Z
(III)
其中R为离去基团，优选活化酯基团，更优选选自
在优选的实施方案中，所述的式(III)化合物可选自(IIIa)所示的化合物：
本发明再一方面还提供了式(III)所示的化合物的制备方法，包括式(III’)化合物脱除羧基保护基得到式(III)化合物的步骤，
其中，W’、X’、Z’分别代表W、X、Z中所有的羧基被保护基保护的形式，所述的保护基优选C1-C6的烷基，优选C1-C4的烷基，特别优选甲基或特丁基；R如式(III)化合物中定义。
在此之前，式(III’)化合物的制备方法可参考WO2005012347和WO2013086927中的公开的方法。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
“人胰岛素类似物”是指人胰岛素中的一个或多个氨基酸残基已被删除和/或被其他氨基酸残基替换的人胰岛素，或包含附加氨基酸残基，即51个氨基酸残基以上的人胰岛素。
“胰岛素衍生物”，在本发明中指在胰岛素A和B-链N-末端的α-氨基或者在B3、B27-B30的赖氨酸残基的ε-氨基处连接了酰化修饰基团，形成了酰化胰岛素，该酰化胰岛素具有如下通式：S-W-X-Y-Z；其中各代码定义如说明书中所定义。
本发明的序列设计基于天然人胰岛素的蛋白质氨基酸序列。全长由A和B链两条链组成。A和B链以二硫键连接，A链内还有一个二硫键，共3个二硫键，均以连线标出。每条链上的氨基酸序号按如下规则命名：如A链1-21位氨基酸分别标为A1，A2，A3……。B链1-30位氨基酸分别标为B1，B2，B3……。此外，如果在A和B链的N端添加氨基酸的话，其标记分别为A0，A(-1)，A(-2)……，B(0)，B(-1)，B(-2)……等。如果在A和B链的C端添加氨基酸的话，其标记分别为A22，A23，……，B31，B32……等。在具体表示人胰岛素衍生物通式时，确定的氨基酸用氨基酸代码表示，有不确定替代或删除的位置用该位的氨基酸序号表示，如本发明的人胰岛素类似物通式所示。
本发明中，所用的B(1-29)是指人胰岛素B1到B29缩短的B链，B(1-30)是指人胰岛素B1到B30的B链，B(1-31)是指人胰岛素B1到B31的B链，B(1-32)是指人胰岛素B1到B32的B链；A(1-21)是指人胰岛素的A链，A(0-21)是指在A0位加一个氨基酸残基的人胰岛素A链。根据本发明的具体实施例，在人胰岛素分子中的取代残基是用参照于人胰岛素的氨基酸序号表示的。例如，B(1-2)-D-B(4-30)，A(1-21)人胰岛素指一个在B链3位上N被D所取代的人胰岛素类似物。序列简写B(1-30)，A(1-21)指天然人胰岛素；B(1-29)，A(1-21)是指B30位缺失的人胰岛素；B(1-2)-K-B(4-28)-E-E，A(1-21)是指B3位为K所取代，B29B30为EE所取代的重组人胰岛素，除非另外加以说明。如果涉及某一位点氨基酸缺失的，也可以用DES的形式表示，例如DES(B30)人胰岛素，表示B30位氨基酸缺失的人胰岛素类似物。此外，与人胰岛素一样，B链和A链是由A(7)Cys和B(7)Cys之间的二硫键，A(20)Cys和B(19)Cys之间的二硫键联结起来的。同时A链含有A(6)Cys和A(11)Cys间的内二硫键。
具体实施方式
以下结合实施例进一步描述解释本发明，但这些实施例并非意味着限制本发明的范围。
实施例1：B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素的制备
1、甲基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OMe的制备
合成路线：
取X01(150g，524.5mmol)，室温下加入干燥的THF(2.5L)，随后加入催化量的DMF(1.0mL)，将草酰氯(49mL)加入到100mL的恒压滴液漏斗中，将草酰氯缓慢滴加到反应瓶中，期间有气体生成，需不断放气，约滴加两小时。滴加完毕后，室温搅拌1.5h，随后减压旋干THF，向反应瓶中加入DCM(800mL)和叔丁醇(500mL)，室温下搅拌过夜。旋干叔丁醇和二氯甲烷，加入二氯甲烷(1L)，过滤，除去不溶固体。滤液旋干过柱。收集所需成分，旋干，石油醚重结晶，得54g产品X02，同时回收二叔丁酯产物X03。
将X02(28.5g，83.3mmol)溶于DCM(200mL)中，室温下加入N-羟基丁二酰亚胺(5.54g，48.1mmol)和二异丙基碳二酰亚胺(7.6mL)，室温搅拌1天，TLC显示基本反应完全。过滤，除去不溶固体，减压旋干溶剂，柱层析纯化，得28.5g X04。
取化合物X04(26g,59.2mmol)和L-1-叔丁基谷氨酸(13.2g,65mmol)溶于四氢呋喃(500mL)中，加三乙胺(9.4mL)，室温搅拌3天，TLC检测反应完全，直接减压旋去溶剂，溶于二氯甲烷(500mL)中，加N-羟基丁二酰亚胺(8.17g,71mmol)和二异丙基碳二酰亚胺(14mL)，室温搅拌1天，过滤除去不溶固体，滤液旋干，粗略柱层析，用二氯甲烷溶解上柱，硅胶200-300目，洗脱剂：PE/EA＝8/1→3/1→1/1(开始出)，得化合物X06(29.8g,81％)。
取化合物X06(1g，1.6mmol)溶于三氟乙酸(5mL)中，室温搅拌2小时反应完全，减压旋三氟乙酸过程中加入无水乙醚，白色固体析出，过滤得到化合物X07(0.6g)。
2、B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素前体的制备
取重组B(1-27)-D-K-E,A(1-21)人胰岛素(按照WO2013086927公开的方法制备得到)50ml(3mg/ml,50mM Tris HCl缓冲液体系)，用1.5M Na2CO3调节pH至约10.75。将甲基十六烷二酰基-Glu(OSu)-OMe(108.5mg，211.5mmol)溶于50mL乙腈后，每隔5min加10mL本溶液到上述上述B(1-27)-D-K-E,A(1-21)重组人胰岛素溶液中开始反应，分5次加完，加完后开始计时，采用RP-HPLC对反应过程进行中控。2h后用三氟乙酸将溶液pH调节至约7.0终止反应得粗品溶液。
3、B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素(HS061)的纯化
将上述前体粗品溶液加入水稀释使有机相含量约15％(v:v)，用0.45μm滤膜过滤后采用RP-HPLC对其进行纯化，其中反相柱为Kromasil C8-100-10，250×4.6mm，流动相A为乙腈，流动相B为0.1M乙酸铵，以0min-5min-55min，A相为15％-24％-29％的梯度变化，1mL/min的流速洗脱产物并收集目标产物得纯化液。
4、B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素的超滤及冻干
将上述纯化溶液用注射水稀释一倍，使其乙腈含量降低到20％以下。用膜包将该溶液用注射水洗涤置换7倍体积，膜包通量5L/m2/min、透过端通量8L/m2/H，其中膜包为3K PLBC 0.1SQM，样品不能透过膜包。将超滤后的样品冻干获得冻干产物27.5mg。所得分子结构式如下。
5、B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素结构确证
B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素采用ESI-MS测定分子量为6251.65，和理论分子量6251.16一致。
B28D-NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-Glu)-B30E人胰岛素用胰蛋白酶解，酶解产物进行LC-MS分析，结果显示两个片段F1和F2的分子量分别为4865和1403，与理论酶解片段分子量相符，其中片段F2对应被修饰的B-链片段。证明修饰位点和预期一致。