本发明涉及穿孔素伴侣蛋白多肽及其应用，具体涉及具有促进促进穿孔素的活性，治疗恶性肿瘤的多肽。
背景技术：
细胞免疫在抗肿瘤效应中发挥着重要的作用。细胞毒性T细胞（CTL）和NK细胞是细胞免疫的重要效应细胞。CTL和NK细胞杀伤靶细胞的主要途径是通过分泌的穿孔素和颗粒酶杀伤靶细胞，其杀伤靶细胞的方式可以是通过穿孔素在靶细胞膜上打孔而使细胞渗透性裂解，还可以和颗粒酶一起使细胞程序化死亡。在对穿孔素缺陷小鼠的研究中发现，穿孔素介导的靶细胞裂解途径在肿瘤消退过程中起着更为重要的作用。
穿孔素(perforin，属于成孔蛋白pore-forming protein，PFP)是一种分子量为67kD，存在于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和NK细胞胞质的细胞毒颗粒中的糖蛋白，又称C9相关蛋白或溶细胞素（cytolysin）。当与靶细胞密切接触相互作用后，细胞可释放穿孔素。穿孔素的作用是在靶细胞膜上形成多聚穿孔素管状通道，导致靶细胞溶解破坏。在Ca2+存在下，插入靶细胞膜上，并多聚化形成管状的多聚穿孔素（polyperforin）。多聚穿孔素在靶细胞膜上形成穿膜的管状结构，内径平均16nm。这种异常的通道使Na+、水分进入靶细胞内，K+及大分子物质（如蛋白质）从靶细胞内流出，改变细胞渗透压，最终导致细胞溶解。此过程与补体介导的溶细胞过程类似，溶解细胞过程比较迅速。 然而，有研究表明，纯化的穿孔素蛋白对靶细胞的杀伤作用大大降低，并证实可能是由于纯化穿孔素缺失了细胞毒颗粒中的一种名为穿孔素增强蛋白（PEP）的分子量为9-15Kd的小分子量蛋白所致，该分子为穿孔素的伴侣蛋白。
因此，发明人设计制备一种能够模拟穿孔素的伴侣蛋白的多肽，能特异性促进穿孔素的活性，起到抑制肿瘤的作用。
目前，没有成熟开发的穿孔素伴侣蛋白多肽问世，用于治疗恶性肿瘤。
技术实现要素：
发明目的
本发明提供全新的序列，该序列为穿孔素伴侣蛋白，对恶性肿瘤具有很好的疗效。
技术方案
穿孔素伴侣蛋白多肽，其特征在于其序列为SEQ ID NO：1。
穿孔素伴侣蛋白多肽在治疗恶性肿瘤，如肝癌药物中的应用。
有益效果
利用固相合成法化学合成穿孔素伴侣蛋白多肽，该多肽具有全新的序列，该多肽可促进穿孔素的活性，治疗恶性肿瘤，如肝癌。我们发现的穿孔素伴侣蛋白多肽可以在体外同时抑制肝癌细胞和肝癌干细胞增殖活力，并可以促进肝癌干细胞的凋亡。体内试验中提高肝癌荷瘤裸鼠生存率，具有潜在的新药开发价值。
具体实施方式
实施例1
穿孔素伴侣蛋白多肽对体外培养人肝癌干细胞细胞凋亡的影响。
将对数生长的人肝癌干细胞，以 1.0×105加入 96 孔培养板中，培养 24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物穿孔素伴侣蛋白多肽(上海生工合成)和阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养 48h后，采用吖啶橙(AO)-溴乙锭(EB)荧光双染法的方法进行；末端脱氧核苷酸转移酶介导DNA 片段末端标记法 (TUNEL法) 按博士德生物工程公司TUNEL-POD 试剂盒说明书方法进行。结果显示，穿孔素伴侣蛋白多肽处理后的肝癌干细胞的凋亡率(AO/EB的凋亡率为15.98±3.09%，TUNEL的凋亡率为40.41±6.73%)与空白组(AO/EB的凋亡率为4.52±0.39%，TUNEL的凋亡率为8.26±1.31%)相比，显著性提高（p<0.05）。
实施例2
穿孔素伴侣蛋白多肽对体外培养人肝癌细胞的生长和存活IC50。
采用 MTT 比色法。将对数生长的人肝癌细胞，以 1.0×105加入 96 孔培养板中，培养 24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物穿孔素伴侣蛋白多肽(上海生工合成)和阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养 48h后，每孔加入 MTT，作用 4h 后，加入 DMSO，孵育 30min，在酶标仪 620nm 处测定吸光度 A 值，按公式人肝癌细胞生长抑制率＝（1-实验组吸光值/对照组吸光值）×100％。计算出实验药物的 IC50 为8.44μM，紫杉醇的IC50 为6.21μM。
实施例3
穿孔素伴侣蛋白多肽对体外培养人肝癌干细胞的生长和存活IC50。
采用 MTT 比色法。将对数生长的人肝癌干细胞，以 1.0×105加入 96 孔培养板中，培养 24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物穿孔素伴侣蛋白多肽(上海生工合成)和阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养 48h，每孔加入 MTT，作用 4h 后，加入 DMSO，孵育 30min，在酶标仪 620nm 处测定吸光度 A 值，按公式人肝癌干细胞生长抑制率＝（1-实验组吸光值/对照组吸光值）×100％。计算出实验药物的 IC50 为6.51μM，而阳性药紫杉醇为IC50为5.21μM。
实施例4
用肿瘤模型检测穿孔素伴侣蛋白多肽的体内活力。
采用裸鼠建立肝癌肿瘤模型，阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的溶剂， 实验组多肽(上海生工合成)设3个剂量：5、10、20 mg/Kg。21天后，观察裸鼠存活数量，计算存活率。结果显示，穿孔素伴侣蛋白多肽可有效地保护荷瘤裸鼠，提高小鼠的生存率，生存率达到77.3%。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州普罗达生物科技有限公司
<120> 一种穿孔素伴侣蛋白多肽及其应用
<130>
<160> 1
<170> Patent In version 3.3
<210> 1
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Pro His His Phe Asn Ala Ser Thr Gln Pro Ala Tyr Leu Arg Leu Ile
1 5 10 15
Ser Asn Tyr Gly Thr His Phe Ile Arg Ala Val Glu Leu Gly Gly Arg
20 25 30
Ile Ser Ala
35