一种漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip‑par1及其制备方法和应用与流程

本发明属于真菌免疫调节蛋白领域，特别涉及一种漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1及其制备方法和应用。

背景技术：

真菌免疫调节蛋白(Fungal immunomodulatory protein，FIP)是从高等担子菌中分离得到的一类具有免疫调节活性的小分子蛋白质。1989年，日本学者Kino从灵芝(Ganoderma lucidum)子实体中分离到第一个真菌免疫调节蛋白，命名为Ling Zhi-8(LZ-8)，并对其基因序列、氨基酸顺序和免疫生理活性进行了测定(Kino K,1989,J Biol Chem)。通过体外实验发现，真菌免疫调节蛋白可以促进小鼠脾细胞和人类周边血淋巴细胞的增生(Hsieh KY,2003,Clin Exp Allergy)，促进T淋巴细胞分泌表达黏附分子ICAM(Wu CT,2011,Carcinogenesis)，增强IL-2，TNF-α和IFN-γ的分泌水平(Li QZ,2011,Crit Rev Biotechnol)，从而提高机体免疫力。同时在动物实验中还观察到真菌免疫调节蛋白可以抑制小鼠产生全身性过敏，或降低局部性免疫过敏的发生率(Lin YL,2009,J Leukocyte Biol)，并且可以减轻一型糖尿病的病情(Kino K,1990,Diabetologia)，过敏和一型糖尿病都是由于机体免疫系统紊乱所致，而真菌免疫调节蛋白具有调节机体免疫系统恢复正常功能的作用。在抗癌方面，真菌免疫调节蛋白对于HL60肿瘤细胞具有很强的抗肿瘤活性(Huang L,2009,Proteins)。并且相对于许多成分复杂难解或化学结构不清楚(如灵芝多糖)的中草药来说，真菌免疫调节蛋白具有简单的化学结构，完全具备成药的条件。因此，真菌免疫调节蛋白拥有良好的临床应用前景和药用保健价值。

目前，已经从灵芝(G.lucidium)、金针菇(Flammulina velutipes)、草菇(Volvariella volvacea)、松杉灵芝(G.tsugae)、紫芝(G.japoncium)、小孢子灵芝(G.microsporum)、甜灵芝(G.sinense)、拱状灵芝(G.fornicatum)、绵腐卧孔菌(Postia placenta)和赤球丛赤壳(Nectria haematococca)中发现真菌免疫调节蛋白，但是还未有在漏斗大孔菌(Amanita muscaria)中发现真菌免疫调节蛋白的相关报道。在大型真菌中挖掘新型真菌免疫调节蛋白资源，对于我国进一步开发有关真菌免疫调节蛋白药物和保健食品，提高我国在食用菌资源开发方面的核心竞争力具有非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1及其制备方法和应用，该漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1能够明显促进脾淋巴细胞增殖、促进肿瘤坏死因子TNF-α的表达等免疫调节作用，因此，在提高机体免疫力方面具有应用潜力。

本发明的一种漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1，所述免疫调节蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的一种编码漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1的基因，所述基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

将漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1的cDNA序列在GenBank中进行BLAST比对，没有发现与其相似的基因序列，而将其氨基酸序列在NCBI的无冗余蛋白序列数据库(nr)中进行BLAST比对发现，该蛋白与来源于小孢子灵芝(G.microsporum)免疫调节蛋白的相似性达到62％，与来自于赤芝(G.lucidum)免疫调节蛋白LZ-8的相似性为57％。

本发明的一种漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1基因的载体。

优选的，所述载体为pET-32a。

将本发明的漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。优选的，将漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1基因插入到pET-32a上的BamHI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组载体pET-Fip-par1。

本发明的一种漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1基因的重组菌株。

优选的，所述重组菌株为Rosetta-Fip-par1。

本发明的一种漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1的制备方法，包括：

(1)将漏斗大孔菌免疫调节蛋白的cDNA序列连入载体中，得到重组载体；

(2)将上述重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(3)培养上述重组菌株，诱导重组漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1的表达；

(4)经NI柱纯化、透析分离获取所表达的漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1。

所述步骤(2)中的宿主细胞为大肠杆菌Rosetta细胞。

本发明的一种漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1的应用，所述免疫调节蛋白用于制备保健食品。

本发明运用基因工程手段获得，以及用于产业化生产漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1产品都未见报道。本发明首次提供了漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1，该蛋白对脾淋巴细胞具有催化分裂的作用，可作用于保健品和医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1。

有益效果

本发明漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1能够明显促进脾淋巴细胞增殖、促进肿瘤坏死因子TNF-α的表达等免疫调节作用，因此，在提高机体免疫力方面具有应用潜力；可以制备出新型的提高人体免疫力的保健食品，防治由于免疫力下降所导致的疾病的危害，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1氨基酸序列与其它真菌免疫调节蛋白氨基酸序列比对结果；

图2为本发明pET-Fip-par1质粒图谱；

图3为本发明漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1表达的SDS-PAGE分析；其中，1为包涵体；2为上清；M为分子量标准；

图4为本发明漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1的分离纯化；

图5为本发明漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1促进脾淋巴细胞增殖实验；

图6为本发明漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1促进肿瘤坏死因子TNF-α的表达。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下述是实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司买得。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

1.细胞株：Rosetta感受态，DH5a感受态。

2.动物：清洁级ICR小鼠，体重18～22g，购于扬州大学实验动物中心。

3.试剂盒、酶类、生化试剂和仪器：

试剂盒：天根质粒提取试剂盒，天根蛋白定量检测试剂盒，上海生工PCR产物回收试剂盒，PCR引物合成和基因测序均由上海生工完成。TNF-αElisa检测试剂盒，CD4+CD62L+T Cell分离试剂盒购于美国BD。

酶类：Takara常规内切酶，Takara DNA T4连接酶，东盛TaqDNA聚合酶。

仪器：艾本德微量加样器、赛默飞世尔离心机、酶联免疫分析仪，上海天能凝胶成像仪、水平电泳槽、垂直电泳槽，江阴诺源恒温培养摇床，新芝超声破碎仪，Biorad电转仪，晶格PCR仪，美国Thermo scientific细胞培养箱、多功能酶标仪，苏州金净生物安全柜，上海蔡康倒置显微镜。

生化试剂：

国药冰乙酸、丙三醇(甘油)、无水乙醇、异丙醇、甲醇、甘氨酸、Tris、氢氧化钠、EDTA、氯化钠、氯化钾、十二水合磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、咪唑、脲、盐酸胍；生工NI树脂、丙烯酰胺、N,N-亚甲叉丙烯酰胺、IPTG；Oxdine胰蛋白胨、酵母提取物；Solarbio氨苄青霉素、卡那抗生素；SDS、β-巯基乙醇、考马斯亮蓝R-250、AP；美国sigmaMTT。

4.培养基：生工LB培养基，美国GIBCORPMI 1640培养基，胎牛血清。

实施例1

漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1基因序列信息与同源性分析：

漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1cDNA序列为339bp，详细序列见SEQ ID NO.2。根据cDNA序列推导出Fip-par1氨基酸序列，共112个氨基酸残基，分子量12.34kDa，理论等电点(pI)为7.85，不稳定系数为32.78，脂肪族系数为73.12，详细序列见SEQ ID NO.1所示序列。

将漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank数据库中进行蛋白质同源性检索，结果发现它与来源于小孢子灵芝(G.microsporum)免疫调节蛋白的相似性达到62％，与来自于平盖灵芝(G.applanatum)免疫调节蛋白的相似性为63％，与来自于赤芝(G.lucidum)免疫调节蛋白LZ-8的相似性为57％,与金针菇(F.velutipes)免疫调节蛋白相似性为55％,与绵腐卧孔菌(P.placenta)免疫调节蛋白相似性为49％，如图1所示。由此可见，漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1与真菌免疫调节蛋白家族在蛋白水平上存在较高的同源性，是一种真菌免疫调节蛋白。

实施例2

漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1基因的合成与表达：

委托上海生工生物工程有限公司完成基因的碱基序列合成，合成的序列构建到克隆载体pUC57上，转化克隆菌株DH5a，提取质粒，以双酶切(BamHI和XhoI)消化后，琼脂糖凝胶电泳，回收Fip-par1基因片段，以连接酶(T4ligase)连接到以BamHI和XhoI消化的pET32a载体上，表达载体pET-Fip-par1转化到表达菌株Rosetta。挑取单克隆，LB液体培养基培养，次日，菌种以1:50扩大培养800mL，37℃培养至OD600＝0.4-0.6，加入0.5mM的IPTG，37℃诱导表达5h。经0.5mM的IPTG，37℃诱导表达5h。如图2所示，将Fip-par1基因片段构建到表达载体pET32a上。

实施例3

重组漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1的分离与纯化：

8000rpm、4℃离心5min，收集诱导表达的菌株，加100mL破碎液进行超声波裂解。裂解条件：温度冰浴、功率60％、超声2s、间隔2s、时间15min。12000rpm、4℃离心15min，收集上清和沉淀。SDS-PAGE检测，判断目的蛋白的表达形式。目的蛋白Fip-par1以可溶性形式存在。过NI柱纯化，收集流穿液、洗脱液，SDS-PAGE检测蛋白纯化效果。如图3、4所示，诱导表达的蛋白通过SDS-PAGE鉴定，分子量大小正确。

实施例4

重组漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1真菌免疫调节蛋白的脾淋巴细胞增殖试验：

(1)脾细胞悬液制备：BALB/c小鼠购得后饲养1周进行免疫学实验。无菌条件下脱颈椎处死，立即切除脾脏，加适量PBS研磨，以100目不锈钢网滤过，并加入红细胞裂解液5min除去溶血的红细胞，1200r/min离心5min，弃上清，加PBS重复洗涤2次。然后加入CD4+CD62L+T Cell分离试剂盒，即得到纯度大于90％的淋巴细胞。淋巴细胞用10％胎牛血清，RPMI 1640培养基进行培养。

(2)淋巴细胞增殖实验：于96孔板中，每孔加100μL脾细胞悬液(1×10⁷个/mL)，实验设置空白组，刀豆蛋白A(ConA)组，Fip-par1组和LZ-8阳性对照组。ConA组、Fip-par1组及LZ-8组分别加入20μL浓度为5μg/mL的ConA作用6h，然后Fip-par1组和LZ-8组分别加入终浓度为100μM的Fip-par1和LZ-8，每孔各100μL。作用12h，每组设置4个复孔。达到作用时间后，向上述细胞板中各加药孔入10μL MTT试剂(MTT需避光，放入培养箱中，4h后弃去孔中液体加入150μL DMSO，震荡使结晶物充分溶解，在多功能酶标仪A570nm测定吸光度，计算细胞增殖情况。

如图5所示，漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1能显著促进脾淋巴细胞的增殖，其效果与LZ-8相当。

实施例5

重组漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1的促肿瘤坏死因子TNF-α的表达：

脾细胞悬液制备及细胞铺板方法与细胞增殖实验一致。

(1)标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μL，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μL，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μL分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μL，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μL弃掉，再各取50μL分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50μL，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μL分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μL，混匀后从第七、第八孔中分别取50μL加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μL，混匀后从第九第十孔中各取50μL弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μL，浓度分别为(300ng/L，200ng/L，100ng/L，50ng/L，25ng/L)。

(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL(样品最终稀释度为5倍)。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

(3)温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。

(4)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

(5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。

(6)加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。

(7)温育：操作同(3)。

(8)洗涤：操作同(5)。

(9)显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min.

(10)终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

(11)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15min以内进行。

如图6所示，漏斗大孔菌免疫调节蛋白Fip-par1能显著促进肿瘤坏死因子TNF-α水平表达，其效果与LZ-8相当。