本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及一种高效的齐考诺肽合成制备方法。
背景技术：
中文名：齐考诺肽
英文名：Ziconotide
分子式C102H172N36O32S7
分子量：2639.13
结构式：
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2
齐考诺肽(Ziconotide)是一种人工合成的非阿托品类镇痛多肽药物，是首个应用于临床的具有神经元特异性的新型非吗啡类镇痛剂。它通过阻断N型钙离子通道而达到镇痛的目的，可缓解其他治疗手段包括鞘内注射吗啡无效的疼痛，且长时间使用该药物不会产生耐受性和成瘾性，应用指征为治疗与创伤、肿瘤和神经痛等相关的慢性疼痛，尤其在治疗对阿片类药物不敏感的难治性疼痛或对阿片类不能耐受的病人方面有独到的优势。基于其良好的疗效，齐考诺肽已引起神经生物学、药理学及药物化学研究者的广泛兴趣。
现有的齐考诺肽制备方法合成周期长，生产成本高，产品收率低，不利于齐考诺肽的大规模生产。申请公布号CN 104974237 A及一种片段法固相合成齐考诺肽的方法，首先采用固相法合成齐考诺肽的4个片段肽[19-25]A、[12-18]B、[6-11]C、[1-5]D；再按照顺序依次将全保护肽片段B、C、D连接到肽树脂A上，裂解得到齐考诺肽线性肽；最后通过条件温和，操作精简，后处理容易，环保的液相一步氧化得到齐考诺肽；该方案不足之处有：齐考诺肽的4个片段肽分布合成，合成步骤较多，操作繁琐。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种纯度高，收率高，工艺简单的齐考诺肽合成制备方法，制备得到的齐考诺肽纯品收率达到30％以上，比现有方法10-20％的收率有大幅度提高，适用于齐考诺肽的规模化生产。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种高效的齐考诺肽合成制备方法，该方法包括以下顺序的合成制备步骤：
(1)、将溶胀、脱保护并洗涤后的氨基树脂与活化的保护氨基酸溶液于30℃的恒温震荡器中反应40-90min，依次接入从树脂端起第1-25个氨基酸相对应的保护氨基酸，得到齐考诺肽前体肽-氨基树脂：
Fmoc-CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC-Rink Resin：
(2)、将上述制得的齐考诺肽前体肽-氨基树脂进行洗脱反应，去掉Cys8和Cys20的侧链保护基，环化反应形成齐考诺肽的第一对二硫键，得到齐考诺肽前体肽Ⅰ-氨基树脂：
(3)、将齐考诺肽前体肽Ⅰ-氨基树脂进行洗脱反应，去掉Cys15和Cys25的侧链保护基，沉降、纯化后进行齐考诺肽的第二对二硫键环化反应，得到齐考诺肽前体肽Ⅱ；
(4)、将齐考诺肽前体肽Ⅱ进行洗脱反应，去掉Cys1和Cys16的侧链保护基，环化反应形成齐考诺肽的第三对二硫键，样品纯化、冻干，得到齐考诺肽纯品多肽；
步骤(1)中所述的氨基树脂为Rink Amide-MBHA Resin，其取代度为0.35～0.5mmol/g；所述的溶胀是指将氨基树脂浸没在DCM溶剂中2h。
步骤(1)中活化的保护氨基酸溶液制备方法为：将保护氨基酸和HOBt加入到离心管中，加入DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加入DIC，混合使其完全溶解得到活化的保护氨基酸溶液。
步骤(1)中所述的保护氨基酸为：Fmoc-Cys(acm)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Cys(mmt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH。
步骤(1)中所述的脱保护并洗涤是指：将溶液抽干后，加入1/3-1/2反应器体积的20％哌啶/DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上振摇反应20min，然后用真空泵将溶液抽干；再加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于脱色摇床上振摇1min，用真空泵将溶液抽干，再次加入DMF溶液洗涤树脂，重复操作3次。
步骤(2)中所述的洗脱反应试剂为0.5％TFA+10％二氯乙酸+DCM溶液，洗脱反应20min；环化反应条件为DCM:DMF＝1：1，加三乙胺调pH至9。
步骤(3)中所述的溶剂洗脱反应试剂为：
6％TFA+2.5％H2O+2.5％Tis+1％EDT+88％DCM，洗脱反应40min；环化反应条件为(NH4)2CO3调pH至8.6，终止反应用5％的醋酸水溶液调节pH到5；所述的沉降选用-20℃低温预冷的无水乙醚，离心沉降3次。
步骤(4)所述的溶剂洗脱反应试剂为98％TFA+1％苯甲醚+1％三氟醋酸银，洗脱反应60min；环化反应条件为向溶液中滴加碘溶液搅拌反应，通过滴加Vc水溶液终止反应。
步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)中所述的洗脱反应中，Cys8和Cys20的侧链保护基为trt，Cys15和Cys25的侧链保护基为mmt，Cys1和Cys16的侧链保护基为acm。
步骤(3)和步骤(4)中所述的纯化选用C18，5um制备柱进行反相高效液相色谱纯化，以B.Cone/％(2→50)，0→60min的梯度程序进行多肽的分离提纯。
本发明的有益效果：本发明采用常见易得、低成本的原料和试剂合成制备，通过工艺优化，齐考诺肽纯品得率达到30-40％，大大提高了齐考诺肽的得率；制备方法操作简单，反应过程取样方便，易于中控，并且合成周期短，生产成本低，产品收率高，利于工业化生产。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员理解，下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
本发明合成制备齐考诺肽，以氨基树脂为起始树脂载体，氨基树脂为Rink Amide-MBHA Resin，其取代度为0.35～0.5mmol/g；通过固相合成法依次缩合齐考诺肽氨基酸序列中相对应的Fmoc-保护氨基酸，经活化剂和缩合剂缩合反应及脱保护剂的脱保护反应，得到齐考诺肽前体肽-氨基树脂，缩合反应中氨基酸投料量为所投氨基树脂摩尔数的2-4倍，缩合反应温度为20-40℃。缩合反应所使用的活化剂和缩合剂分别为DIC、HOBt，缩合反应时间为20-50min；脱保护剂为20％哌啶/DMF的混合溶液，洗脱时间为15-30min。通过采用特殊的半胱氨酸原料，以特有的洗脱方法分别脱除半胱氨酸的侧链保护基，进行二硫键环化反应，纯化并冻干，到齐考诺肽纯品多肽。
齐考诺肽纯化工艺中选用C18，5um制备柱进行反相高效液相色谱纯化，以B.Cone/％(2→50)，0→60min的梯度程序进样多肽的分离提纯，收集目标多肽溶液并冻干，得到齐考诺肽纯品多肽。
实施例一
齐考诺肽前体肽-氨基树脂的合成
1、氨基树脂的溶胀
称量取代度为0.38mmol/g的Rink-MBHA-Resin0.1g，从开口端加入至多肽合成反应器中，取DCM试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，与溶剂充分接触，溶胀2h。
2、齐考诺肽前体肽-氨基树脂的合成
齐考诺肽前体肽-氨基树脂的为：
Fmoc-CKGKGAKCSRLMYDCCTGSCRSGKC-Rink Resin
本实施例使用的保护氨基酸从树脂起算第1-25个氨基酸相对应的保护氨基酸以及分子量如下表1所示：
表1
本发明中一些常用的缩写具有以下含义：
保护氨基酸的活化方法
以Fmoc-Cys(mmt)-氨基树脂的缩合为例，按照计算的理论投料量称取34mg Fmoc-Cys(mmt)-OH和23mg HOBt于离心管中，加2ml DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加10ul DIC，混合均匀得到活化的保护氨基酸溶液。
树脂的脱保护以及洗涤方法
将氨基树脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反应器体积的20％哌啶与DMF混合溶液，置于30r/min的脱色摇床上振摇反应20min，然后用真空泵将脱保护溶液抽干；再加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于脱色摇床上振摇1min，用真空泵将溶液抽干，再次加入DMF溶液洗涤树脂，重复操作3次。
茚三酮显色检测合格后，将上述的保护氨基酸溶液加到抽干的反应器中，再将反应器置于30℃的恒温震荡器中反应20-50min。采用上述同样方法，依次接入第2-25个氨基酸对应的Fmoc-保护氨基酸，即得到齐考诺肽前体肽-氨基树脂。
实施例二
齐考诺肽前体肽Ⅰ-氨基树脂的合成
将齐考诺肽前体肽-氨基树脂进行洗脱反应，去掉Cys8和Cys20的侧链保护基，洗脱反应试剂为0.5％TFA+10％二氯乙酸+DCM的混合溶液，洗脱反应20min；抽干洗脱液，然后以DCM:DMF＝1：1的溶液环化反应形成齐考诺肽的第一对二硫键，加三乙胺调pH至9，得到齐考诺肽前体肽Ⅰ-氨基树脂。
实施例三
齐考诺肽前体肽Ⅱ的合成
将齐考诺肽前体肽Ⅰ-氨基树脂进行洗脱反应，去掉Cys15和Cys25的侧链保护基，洗脱反应试剂为6％TFA+2.5％H2O+2.5％Tis+1％EDT+88％DCM的混合溶液，洗脱反应40min；将反应液用-20℃低温预冷的无水乙醚进行离心沉降、冻干，得到的样品以反相高效液相色谱法纯化，冻干得到纯品样品；将样品溶解然后以(NH4)2CO3调pH至8.6进行齐考诺肽的第二对二硫键环化反应，终止反应用5％的醋酸水溶液调节pH到5，得到齐考诺肽前体肽Ⅱ。
实施例四
齐考诺肽纯品的合成制备
将齐考诺肽前体肽Ⅱ进行洗脱反应，去掉Cys1和Cys16的侧链保护基，洗脱反应试剂为98％TFA+1％苯甲醚+1％三氟出酸银的混合溶液，洗脱反应60min，将反应液用-20℃低温预冷的无水乙醚进行离心沉降、冻干，得到的样品以反相高效液相色谱法纯化，冻干得到纯品样品；将样品溶解然后向溶液中滴加碘溶液搅拌反应，形成齐考诺肽的第三对二硫键，通过滴加Vc水溶液终止反应；将反应液纯化、冻干，得到齐考诺肽纯品多肽。
环化反应条件为向溶液中滴加碘溶液搅拌反应，通过滴加Vc水溶液终止反应。
齐考诺肽及其中间体，采用反相高效液相色谱法纯化制备除杂，制备条件为：C18制备柱，流动相为A(0.1％乙酸/水)/B(0.1％乙酸/乙腈)，流速9ml/min，制备梯度程序为
将上述纯化后的齐考诺肽样品冻干，称量得到齐考诺肽纯品多肽14mg，经计算分析，其纯度达到98％，纯品收率为32.3％，比现有技术仅10-20％的收率有大幅度的提高。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。