本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于定性检测蔓越莓成分taqman实时荧光pcr方法，用于所述方法的寡核苷酸引物探针组合物，以及包含所述组合物的试剂盒。
背景技术：
蔓越莓又名蔓越橘、小红莓，是杜鹃花科越橘属红莓苔子亚属（学名：oxycoccos，又名毛蒿豆亚属）的俗称，此亚属的物种均为常绿灌木，主要生长在北半球的凉爽地带酸性泥炭土壤中。目前在北美的一些地区被大量的种植蔓越莓在北美的一些地区被广泛种植，收获的果实用作鲜食、冷冻果、干果、蜜饯、果汁、果酱等。蔓越莓还具有特殊的医疗价值。在全球三个洲不断进行的研究表明，蔓越莓所含有的天然成分能清除消化系统内有害的幽门螺旋杆菌，每日饮用两杯蔓越莓果汁，有利于泌尿系统的健康；蔓越莓果实含有抗氧化物质，具有抗衰老、抗癌等作用。可以说，蔓越莓是一种高附加值、高回报率的小浆果，是当今世界果品发展中方兴未艾的小浆果类果树品种之一。目前，我国市场已有少量的蔓越莓果酱、蛋糕、酸奶和果汁饮料等产品在销售。但是，蔓越莓原料仍然主要依靠进口，因此，高昂的价格促使蔓越莓掺假现象愈演愈烈，掺假方式多种多样，令人防不胜防。
目前开展的蔓越莓等果实产品鉴别方法主要有两种，第一是常规理化法，如色谱技术、光谱技术、质谱技术、电子鼻及电子舌技术，主要对果汁产品主要成分包括可溶性固形物、总糖、总酸等常规物质，及果汁中的特定成分如无机元素、还原糖、有机酸、氨基酸及其它成分的检测，澄清度和产生沉淀的量进行鉴别。虽然较为快速，但这些技术很大程度上会受到品种、产地、收获季节、原料环境、加工条件、贮运包装方式等很多因素的影响，要保证其方法的可靠性就需要大量的检测样本和科学的数理模型分析技术。面对果汁掺假问题，简便、快捷、特异的检测技术研究与开发迫在眉睫。分子生物学技术以其方便、准确、迅速、简洁的特点，从基因水平分析食品原料和产品的特性和来源，灵敏度更高、特异性更强，其结果为证明食品的真伪提供了真实、可靠的依据，已成为近年来国内外学者研究的热点。
技术实现要素：
本发明的目的在于，简单、快速、特异且灵敏地检测食品及果汁（清汁除外）中的蔓越莓成分，能有效防止果汁、果酱等蔓越莓产品中添加其他廉价水果的造假方式。
本发明的发明人根据果蔬内参基因nadh，设计了能够通用于果蔬内参照的实时荧光pcr检测方法；以蔓越莓花青苷dfr基因为目标，设计了能特异性检测蔓越莓成分的引物和探针，靶序列172bp，保证能从果酱、果汁等沉淀中检测目标植物成分。
在本发明的一个方面，提供了通用于果蔬成分内参照的寡核苷酸引物上游nadh-f:5’-gctgaagcagctactttcgaagtaaca-3’（seqidno.1），和下游nadh-r:5’-aggagccgtgtgagatgaaagtctca-3’（seqidno.2）。探针为nadh-p:5’-tggagtgggagagtcagagtcgaaaagagg-3’（seqidno.3），在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团tamra，5’端连接有一个荧光报告基团fam。该引物可特异性识别果蔬成分的nadh序列，扩增片段长度138bp。特异性扩增反应条件为：50℃2min；95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。
在本发明的一个方面，还提供了特异性检测蔓越莓成分的特异性寡核苷酸引物上游cranberry-f：5’-cggtgtgctaagcataataaagtct-3’（seqidno.10），和下游cranberry-r：5’-catccagccagtcatctttatctta-3’（seqidno.11）。探针为cranberry-p：5’-agtcgctccagttgttttcatcaaacgtc-3’（seqidno.12），在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团tamra，5’端连接有一个荧光报告基团fam。该引物可特异性识别蔓越莓的花青苷基因dfr序列，扩增片段长度172bp。特异性扩增反应条件为：50℃2min；95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，50个循环。
在本发明的另一个方面，提供了包含上述寡核苷酸序列的组合物。，所述组合物包含选自以下（1）至（2）中的任意一组或多组引物和探针序列：
（1）果蔬内参照基因寡核苷酸引物对seqidno.1~seqidno.2以及探针seqidno.3序列；
（2）蔓越莓特异性寡核苷酸引物对seqidno.4和seqidno.5以及探针seqidno.6序列。
在一个实施方式中，果蔬内参基因和蔓越莓实时荧光pcr扩增条件是50℃2min；95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，50个循环，为优选地，本发明所使用的实时荧光pcr方法为taqman荧光探针法。
在本发明中，蔓越莓含含大果红莓苔子（美洲蔓越橘），小果红莓苔子，红莓苔子，南方蔓越橘四个品种群。
在本发明的另一个方面，提供了用于果蔬成分通用检测试剂盒，蔓越莓成分实时荧光pcr特异性检测试剂盒，所述试剂盒中包含所述寡核苷酸序列或所述组合物。
本发明提供的试剂盒包括本发明的用于实时荧光pcr检测果蔬成分及蔓越莓成分特异性引物和使用说明书。
在一个实施方案中，本发明的蔓越莓特异性引物分别根据花青苷dfr基因序列设计。在一个实施方案中，所述试剂盒中包含蔓越莓（以高丛蔓越莓为例）特异性扩增靶序列为:cggtgtgctaagcataataaagtcttgcacaaaagcaaagacagtcaagaggctggtgttcacatcgtctgctggaaccgtcaatgttcaagagcaccaacaaccgacgtttgatgaaaacaactggagcgacttggattttatctataagataaagatgactggctggatg(seqno.7)，在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于是实时荧光pcr检测蔓越莓特异性引物和扩增条件的描述。在一个具体的实施方案中，本发明的用于检测蔓越莓成分的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。
在一个实施方案中，所述实时荧光pcr检测方法检测出蔓越莓成分的绝对灵敏度最低为0.01ng/μl。
在一个实施方案中，所述实时荧光pcr检测方法的最低检出限为体积比5%的蔓越莓成分。
再在一方面，本发明提供了所述组合物或所述试剂盒在鉴别果汁（清汁除外）、果酱等蔓越莓制品中蔓越莓成分的应用。
实时荧光定量pcr即在常规pcr方法的基础上，加入荧光标记的探针或者荧光染料，随着pcr产物的积累，探针或染料发出的荧光信号增强，而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每产生一条dna链，就有一个荧光分子形成，整个pcr反应过程随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得ct(cyclethreshold,ct)值。ct值，即pcr扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板dna量越多，荧光达阈值的循环数越少，即ct值越小，从而实现对起始模板定量及定性的分析，从而可检测待测成分。
本发明的通过引物或探针与模板的特异性杂交来鉴别模板的实时荧光pcr检测方法特异性高，假阳性低；可采用完全闭管检测，无需pcr后处理，避免了交叉污染和假阳性，缩短了反应时间。检测pcr扩增后的荧光，放大了反应信号，灵敏度大大提高。本发明的方法巧妙地运用了pcr技术的dna高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。使用本发明的实时荧光pcr检测方法，其简单、快速、特异且灵敏的特点适合用于国内外市场上果汁（清汁除外）、果酱等制品中蔓越莓成分的定性检测。
附图说明
图1是利用实时荧光pcr检测果蔬内参照引物探针通用性时，果蔬出现的典型的扩增曲线。浆果及常见果疏1-40分别为：蔓越莓（北陆、灿烂、蓝金、比洛克西）、黄树莓、红树莓（胜利）、黑树莓、蔓越莓、红豆越橘、宾川夏黑葡萄、黑加仑、灯笼果、石榴、蛇莓、草莓、山楂、猕猴桃、桑葚、樱桃、杨梅、杨桃、苹果、梨、蟠桃、碧桃、橙、桔、杏、西瓜、木瓜、黄瓜、枇杷、菠萝、荔枝、龙眼、香蕉、番茄、枸杞、芒果、橄榄；阴性对照41-48分别为：松树、水杉、木耳、香菇、绿藻、大肠杆菌、酵母、空白。
图2是使用蔓越莓引物探针特异性检测结果。图中1为蔓越莓（北美），2-36依次为蓝莓、红树莓（胜利）、黄树莓、黑树莓、蔓越莓、蛇莓、桑葚、猕猴桃、草莓、黑加仑、宾川夏黑葡萄、樱桃、杨梅、杨桃、苹果、梨、蟠桃、碧桃、枣、橙、桔、杏、西瓜、木瓜、芒果、黄瓜、枇杷、菠萝、荔枝、龙眼、番茄、枸杞、橄榄、银杏、香蕉及空白对照。
图3是使用蔓越莓引物探针覆盖度检测结果。图中蔓越莓共有5个品种：有大果红莓苔子（加拿大、美国、智利），小果红莓苔子（黑龙江、大兴安岭）2个品种群。
图4是使用蔓越莓引物探针绝对灵敏度检测结果。a表示蔓越莓引物探针扩增得到的典型扩增曲线，b表示蔓越莓引物探针扩增得到的标准曲线。1-5分别表示蔓越莓dna浓度为100ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，0.1ng/μl，0.01ng/μl，每个稀释度3个平行。
图5是使用蔓越莓引物探针相对灵敏度检测结果。1-5分别表示体积比为0.1%，1％，10％，50％，100％比例混合的蔓越莓/玫瑰香混合果汁样品。
图6是使用蔓越莓引物探针扩增模拟加工处理的5％比例的蔓越莓/玫瑰香混合样品低限稳定性检测结果。p表示新鲜的蔓越莓dna。1-3分别表示新鲜、巴氏消毒、高压灭菌处理的5%蔓越莓/夏黑葡萄混合果汁样品。
具体实施方式
通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。