一种在待测样品中检测菠萝成分的方法与流程

本发明属于食品成分检测领域，更具体地，本发明涉及一种在待测样品中检测菠萝成分的方法。

背景技术：

菠萝(Ananas comosus)属凤梨科(Bromeliaceae)凤梨属(Ananas)，又被称为凤梨，是多年生常绿草本植物，是营养价值很高的水果。菠萝主要产区在南北回归线之间，集中在泰国、菲律宾、印尼、越南、巴西、南非和美国等，中国是菠萝十大主产区之一，集中在广东、海南、广西、福建、云南等地。菠萝传统加工产品主要有罐头和果汁两类，菠萝罐头曾被誉为“罐头之王”、菠萝果汁也因其独特的保健功能深受消费者喜爱，世界菠萝汁贸易额迅速增长，近来新兴的菠萝果酒，采取果肉取汁，果胶量及甲醇都远低于葡萄酒，安全性高且健康。然而在经济利益的驱使下，一些不法商家在食品的加工过程中，常常以价格低廉的原料替代或掺入低价格的原料，甚至根本不添加标识的原料成分，以次充好。在加工食品的造假掺假过程中，经常会使用有毒有害物质，这不仅损害了消费者健康，同时会影响食品行业的健康发展。中国多部法律法规明令禁止食品的造假掺假行为，《中华人民共和国产品质量法》、《中华人民共和国食品安全法》、《预包装食品检测标准》和《食品标识管理规定》(国家质量监督检验检疫总局令第102号)等法律法规规定正确标识食品标签，禁止产品的造假掺假行为。目前还未见有水果及其加工产品中菠萝成分的真实性鉴定检测方法。

生物物种资源在生物品种改良、农业生产方面有重要的作用。生物物种资源涉及范围相当广泛，不仅包括种苗、种畜禽、中药材、野生动物，甚至还有人类及动物遗传资源。中国是世界上生物资源种类最多的国家之一，但是因为物种资源保护不力，中国的物种资源正在大量的流失。生物物种资源带有重要生物遗传信息，是一种重要的遗传资源，能够转化为巨大的商业价值，是一种重要的知识产权；遗传资源已经被确定是国家主权的一种。为保护生物物种资源，中国必须加强物种资源种类调查、加强出入境查验体系、建立鉴别检测方法。菠萝等植物也是中国重要的物种资源之一。

为了更好地保护消费者的合法权益以及中国物种资源种类，建立快速、高效、准确的菠萝成分的鉴别检测方法尤为重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种在待测样品中检测菠萝成分的方法。

在本发明的第一方面，提供一种特异性鉴定菠萝成分的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物进行实时荧光PCR检测。

在一个优选例中，所述的实时荧光PCR检测应用SEQ ID NO:3所示的探针。

在另一优选例中，所述的待测样品是食品、饮料或遗传物质材料。

在另一优选例中，所述方法的检测灵敏度为0.01ng/μL菠萝DNA。

在本发明的另一方面，提供一种引物，所述引物是引物对，其序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

在本发明的另一方面，提供一种探针，述的探针序列如SEQ ID NO:3所示。

在本发明的另一方面，提供所述的引物和所述的探针的用途，用于从待测样品中鉴定菠萝成分。

在本发明的另一方面，提供一种鉴定菠萝成分的试剂盒，其中包括所述的引物。

在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：所述的探针；和/或含有菠萝成分的检测标准品。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂，Taq酶，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定菠萝成分的方法的使用说明书。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、菠萝成分的实时荧光PCR特异性检测。

1：中国菠萝品种；

2：台湾菠萝(凤梨)；

3：菲律宾都乐菠萝；

4：菠萝干；

5：其他动植物样品、阴性对照。

图2、不同DNA浓度菠萝的实时荧光PCR检测灵敏度。

扩增曲线从左到右分别为：100ng/μL菠萝DNA、10ng/μL菠萝DNA、1ng/μL菠萝DNA、0.1ng/μL菠萝DNA、0.01ng/μL菠萝DNA。

图3、不同含量菠萝粉的实时荧光PCR检测灵敏度。

扩增曲线从左到右分别为100％菠萝粉、10％菠萝粉、1％菠萝粉、0.1％菠萝粉。

图4、不同基质菠萝粉的实时荧光PCR检测。

1：阳性对照；

2：0.1％菠萝-饼干粉；

3：0.1％菠萝-香肠肉粉；

4：0.1％菠萝-蓝莓粉；

5：菠萝-牛肉骨粉；

6：0.1％菠萝-水溶液；

7，8：阴性对照。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究和试验，首次揭示一种可特异性鉴定菠萝成分的引物，所述引物针对含有菠萝成分的DNA可发生特异性扩增(获得阳性结果)，而对没有菠萝成分的DNA不发生特异性扩增(获得阴性结果)。为了简化PCR扩增方法，本发明人还设计了配合所述引物的、用于进行实时荧光PCR的Taqman探针。采用所述的引物配合Taqman探针，可良好地应用于鉴定菠萝成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。

如本文所用，所述的“菠萝成分”是指特异性来自于菠萝(Ananas comosus)的成分，可以是菠萝本身或其加工产品，如菠萝粉、菠萝饮品。

目前开发有效的鉴定菠萝成分的方法的难点在于各种菠萝制品(如粉或饮料)通常在外观上非常相近，导致人们难分真伪。一些价格低廉的原料制成的产品通过调味可使得口味上与真品难分真伪。即使采用一些基因或蛋白水平上的技术，也由于与多种植物在亲缘关系上较近，难以找到符合标准的、检测准确性高、实用性强的检测靶标。并且，由于物种具有多样性，且物种基因组中存在基因序列的数目是相当可观的，各种基因的DNA排列各异。因此，获得可特异性鉴定一种物种、不受其它类似物种干扰、准确性高的检测试剂是存在很大技术难度的，大量的筛选在所难免。

为此，本发明人经过深入的研究和大量的筛选，找到了合适的检测靶标，设计了仅对菠萝具有良好特异性的引物和探针，所述引物对没有菠萝成分的DNA不发生特异性扩增。基于此开发了实时荧光PCR检测菠萝成分的方法。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)从基因水平分析食品原料和产品的特性及来源，具有方便、准确、快速的特点。

因此，本发明提供一种引物，所述的引物具SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本发明的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。

本发明还提供一种探针，所述的探针具SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；较佳地，所述的探针是Taqman探针，从而便于实时荧光检测。

利用本发明的引物及探针，只需进行PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应的PCR产物的有无，就可以准确、快速地判断待测样品是否含有菠萝成分，而且所需的样品量很少，对于微量的菠萝成分也能检出，灵敏度达到0.01ng/μL菠萝DNA。

基于本发明所提供的适用于鉴定菠萝成分的特异性引物及探针，本发明还提供了一种鉴定菠萝成分的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含菠萝成分。

聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。

作为本发明的优选方式，利用所述引物，采用Taqman实时荧光PCR方法来进行菠萝成分的鉴定。TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。

获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。

本发明还涉及一种用于鉴定菠萝成分的试剂盒，所述试剂盒中含有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物；更佳地，所述的试剂盒中还含有SEQ ID NO:3所示的探针。

此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定菠萝成分的试剂，如(但不限于)：

(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于：Taq酶，PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等；或

(B)各种提取DNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于：酚、氯仿、异戊醇、NaCl等；或

(C)提取DNA的试剂盒。

此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定菠萝成分的使用说明书和/或标准操作程序。

本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测菠萝成分的目的。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示一种可特异性鉴定菠萝成分的引物，所述的引物特异性良好，对于菠萝以外的其它物质则不能特异性扩增。并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。

(2)利用所述的引物或含有所述引物的检测试剂盒，可快速、大批量地检测菠萝成分，从待测样品中快速准确地区分真假菠萝成分，并且所需样品量少，操作简单。

(3)本发明应用Taqman实时荧光PCR技术，可快速实现食品中菠萝源性成分的准确鉴定。

(4)首次建立食品、饮料、遗传物质材料、基因或核苷酸混合液中菠萝的实时荧光PCR检测方法。本发明为保障产品的质量、保护消费者知情权和选择权，遗传物质种类鉴定等提供了有效的技术支撑。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1、材料、试剂与仪器

菠萝样品：中国菠萝，台湾菠萝(凤梨)，菲律宾都乐菠萝，菠萝干。中国菠萝和菠萝干来自中国大陆、台湾菠萝(凤梨)来自中国台湾；菲律宾都乐菠萝来自菲律宾。

57种常见的非菠萝动植物样品包括：火龙果、橙子、提子、猕猴桃、香蕉、牛油果、木瓜、黑布林、蓝莓、释迦、莲雾、百香果、哈密瓜、青枣、菠萝蜜、苹果、人参果、橘子、梨、山竹、葡萄柚、柠檬、番石榴、樱桃、蜜梨、石榴、柿子、杏、西柚、甜瓜、水蜜桃、芒果、红毛丹、枇杷、洋葱、白萝卜、胡萝卜、番茄、黄瓜、芹菜、马铃薯、红薯、豌豆、黑豆、大豆、花生、大米、小米、玉米、小麦、大麦、牛肉、山羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉，用于菠萝成分的特异性检测。

在上海超市、农贸市场购买含菠萝成分产品(菠萝干、菠萝粉、菠萝果汁、菠萝罐头)共10份，购买其他不包含菠萝成分的样品(罐头、果酱、饼干、面包、调味品、乳制品、肉制品、饮料等)共40份，用于检测本发明的方法的实际应用。

试剂DP323动物基因组提取试剂盒、DP305植物基因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。

实时荧光PCR混合液Taqman Gene Expression Master Mix购自美国应用生物系统公司。

仪器BioPhotometer plus核酸蛋白含量测定仪，德国Eppendorf公司；ABI 7500实时荧光PCR仪，美国应用生物系统公司；低温冷冻高速离心机，德国Eppendorf公司。

2、样品的制备

使用冷冻研磨机将动植物样品磨成粉状，用于物种特异性检测。

用小麦粉与菠萝粉混合，将菠萝粉配制成10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％(W/W)的预混样品，提取DNA。

用小麦粉、牛肉骨粉和果酱与菠萝粉混合，分别将菠萝粉样品分别配制成菠萝质量分数为0.1％的混合样品，提取DNA，进行质量灵敏度测试。

3、DNA的提取

使用天根动物基因组提取试剂盒天根生化科技有限公司，目录号：DP323提取动物样品的DNA，提取方法详见试剂盒操作说明书。

使用植物基因组提取试剂盒目录号：DP305提取植物样品的DNA，提取方法详见试剂盒操作说明书。

使用BioPhotometer plus核酸蛋白含量测定仪Eppendorf测定核酸浓度。

清液DNA的提取：将果汁样品或水溶液上下颠倒均匀。取约30mL清液至一洁净培养皿中，抽真空冻干；称取0.2g冷冻干物质至一洁净50mL离心管中，然后加入5mL CTAB裂解液，65℃孵育1h，间期不断混匀几次；8000g离心15min，取1mL上清液至1只洁净2.0mL离心管中。然后加入700μL氯仿，剧烈混匀30s，14500g离心10min，取650μL上清液至洁净2.0mL离心管中，加入1300μL CTAB沉淀液，剧烈混匀30s，室温静置1h；14500g离心20min，弃上清液，加入350μL 1.2mol/L NaCl，剧烈振荡30s，再加入350μL氯仿，剧烈混匀30s，14500g离心10min；分别取上清液320μL，加入0.8倍体积异丙醇，混匀后，-20℃1h，14500g离心20min，弃上清液，加入500μL 70％乙醇，混匀后，14500g离心20min，弃上清液，晾至风干，加入30μL ddH₂O溶解，-20℃贮存备用。

浊果汁DNA的提取：将果汁样品上下颠倒均匀。取约30mL果汁至一洁净离心管中，8000g离心10min，去上清，加入5mL CTAB裂解液，65℃孵育1h，间期不断混匀几次；8000g离心15min，取1mL上清液至1只洁净2.0mL离心管中。然后加入700μL氯仿，剧烈混匀30s，14500g离心10min，取650μL上清液至洁净2.0mL离心管中，加入1300μL CTAB沉淀液，剧烈混匀30s，室温静置1h；14500g离心20min，弃上清液，加入350μL 1.2mol/L NaCl，剧烈振荡30s，再加入350μL氯仿，剧烈混匀30s，14500g离心10min；分别取上清液320μL，加入0.8倍体积异丙醇，混匀后，-20℃1h，14500g离心20min，弃上清液，加入500μL 70％乙醇，混匀后，14500g离心20min，弃上清液，晾至风干，加入30μL ddH₂O溶解，-20℃贮存备用。

用1×TE缓冲液将菠萝DNA溶液分别稀释成10、1、0.1、0.01、0.001ng/μL的DNA混合样品，用于灵敏度测试。

4、引物和探针序列

菠萝成分鉴别的靶序列设计引物及探针序列如下：

正向引物：5′-AGATTTCGGTAAGAGCAGGCAT-3′(SEQ ID NO:1)，

反向引物：5′-GCGAGATGACTTTGGGTTTTG-3′(SEQ ID NO:2)，

探针：5′-FAM-AAGCCACAGGTATAACAC(SEQ ID NO:3)-MGB-3′。

使用18S rRNA真核生物通用引物来鉴定所提取的动植物样品的DNA提取质量。18S rRNA引物序列为：

正向引物：5′-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3′(SEQ ID NO:4)，

反向引物：5′-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3′(SEQ ID NO:5)，

探针：5′-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC(SEQ ID NO:6)-TAMRA-3′。

5、实时荧光PCR反应

实时荧光PCR采用25μL反应体系：

2×PCR反应预混液12.5μL，

引物(5μmol/L)各1μL，

探针(5μmol/L)1μL，

模板DNA(10～100ng)1.0μL，

去离子水补足体系。

扩增条件为：

50℃2min；

95℃10min；

95℃15s，60℃60s，共40个循环。

使用实时荧光PCR仪进行定性检测。

实施例1、真核生物特异引物18S rRNA引物的检测结果

用真核生物18S rRNA通用引物(SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5)及探针(SEQ ID NO:6)，扩增本实验提取的所有DNA溶液。

扩增结果显示，所有样品DNA溶液均出现扩增曲线。

因此，用于菠萝成分特异性检测和方法实际应用的样品DNA溶液均适合于PCR测试。

实施例2、菠萝成分的实时荧光PCR特异性检测

供试的动植物材料：火龙果、橙子、提子、猕猴桃、香蕉、牛油果、木瓜、黑布林、蓝莓、释迦、莲雾、百香果、哈密瓜、青枣、菠萝蜜、苹果、人参果、橘子、梨、山竹、葡萄柚、柠檬、番石榴、樱桃、蜜梨、石榴、柿子、杏、西柚、甜瓜、水蜜桃、芒果、红毛丹、枇杷、洋葱、白萝卜、胡萝卜、番茄、黄瓜、芹菜、马铃薯、红薯、豌豆、黑豆、大豆、花生、大米、小米、玉米、小麦、大麦、牛肉、山羊肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉；中国菠萝，台湾菠萝(凤梨)，菲律宾都乐菠萝，菠萝干。

使用菠萝成分鉴别引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)和探针(SEQ ID NO:3)，对供试的动植物材料DNA样品进行实时荧光定量PCR检测，PCR方法如“5、实时荧光PCR反应”。

结果如图1，4种不同来源的菠萝样品均出现明显的扩增曲线，而其他各种非菠萝供试样品均无扩增检测结果。

上述结果表明，本发明设计的菠萝鉴别引物及探针具有菠萝这一物种的特异性。

实施例3、菠萝成分的实时荧光PCR检测灵敏度

1、菠萝DNA样品

用双蒸水将100ng/μL中国菠萝DNA溶液10倍系列稀释，配成100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL菠萝DNA溶液。使用菠萝成分鉴别引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)和探针(SEQ ID NO:3)，对100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL菠萝DNA溶液进行检测。

结果如图2，可见100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL菠萝DNA出现扩增，0.001ng/μL菠萝DNA未出现扩增。

上述结果表明，对于菠萝DNA，应用本发明的方法检测的灵敏度为0.01ng/μL菠萝DNA。

2、菠萝粉样品

用小麦粉10倍系列混合配制不同含量的菠萝粉样品。使用菠萝成分鉴别引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)和探针(SEQ ID NO:3)，对100％、10％、1％、0.1％、0.01％、0.001％(W/W)菠萝粉含量的样品DNA进行检测。

结果如3，100％、10％、1％、0.1％菠萝粉出现扩增，0.01％、0.001％菠萝粉未出现扩增。

上述结果表明，对于菠萝粉样品，应用本发明的方法检测的灵敏度为0.1％菠萝粉(W/W)。

实施例4、实际样品的检测

1、不同基质的菠萝粉成分检测

用饼干粉、香肠肉粉、蓝莓酱、牛肉骨粉、水将菠萝粉样品配成0.1％菠萝粉混合样品。使用菠萝成分鉴别引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)和探针(SEQ ID NO:3)对提取的菠萝粉混合样品DNA进行检测。

结果如图4，0.1％菠萝-饼干粉、0.1％菠萝-香肠肉粉、0.1％菠萝-蓝莓粉、0.1％菠萝-牛肉骨粉、0.1％菠萝-水溶液DNA均出现扩增。

实验表明，本发明的菠萝成分检测方法适用于动植物加工产品及水溶液样品，且检测灵敏度能达到0.1％菠萝粉(W/W)。可见，本发明的方法对于复杂样品仍然保留较好的检测灵敏度。

2、实际样品的检测

收集市售的50种样品，包括：2个新鲜菠萝、2个菠萝干、2个菠萝罐头、2个菠萝汁、2个菠萝酸奶样品、5种罐头、5种果酱、5种饼干、5种面包、5种调味品、5种乳制品、5种肉制品、5种饮料。

将收集的市售样品提取DNA，进行检测。

抽样结果显示，在菠萝和菠萝干中能检出菠萝成分。在菠萝罐头、菠萝汁、菠萝酸奶样品中也检出菠萝成分。

在40份未含菠萝成分的样品中，均未检出菠萝成分。可见，本发明设计的检测试剂特异性良好，完全适用于食品检验。

结论

本发明提供的食品中菠萝成分实时荧光PCR检测方法，与对照组样品无交叉反应，检测灵敏度为菠萝粉0.1％(W/W)。该方法特异性强、灵敏度高，能准确检测出食品、饮料、饲料、DNA溶液和未知样品中的菠萝成分。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。