一种快速对光倒刺鲃不同群体进行分类的试剂盒的制作方法

本发明属于水产遗传分类技术领域，具体地说，对光倒刺鲃不同群体进行分类的试剂盒。

背景技术：

光倒刺鲃（Spinibarbus hollandi）属鲤形目，鲤科，鲃亚科，倒刺鲃属。具有个体大、生长快、食性广、耐低氧、抗病力强、易养殖等优点。分布于长江、钱塘江、闽江、九龙江、珠江、元江、台湾岛及海南岛等诸水系。不同流域的光倒刺鲃长相相似，通过形态学分辨不同流域的光倒刺鲃较为费力且不准确。此试剂盒使用分子标记的的方法，快速简便的对不同的光倒刺鲃群体进行分类。

串联重复序列（SSR）是一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星序列，是一类由几个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。通过电泳可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。SSR标记具有以下优点：1.数量丰富，覆盖整个基因组，多态性高；2.具有多等位基因的特性，提供的遗传信息量高；3.以孟德尔方式遗传，呈共显性。在光倒刺鲃的种群分类中引入该方法，并将多条长度不一的SSR产物相组合，以最快最简洁的方法对光倒刺鲃的群体进行鉴定分类。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决上述问题，提供一种快速对光倒刺鲃不同群体进行分类的试剂盒，有效降低试验的工作量，提高准确度。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

一种快速对光倒刺鲃不同群体进行分类的试剂盒，所述的试剂盒包括taq酶预混液、蒸馏水、引物，所述的引物包括试剂1、试剂2和试剂3，试剂1、试剂2和试剂3为含有4种SSR引物的混合试剂，试剂1包括产物长度分别为109bp、150bp、202bp、273bp的SSR的引物，引物序列分别为CCTGTGAAATGATTCCATGC，CTTTGACGTAAAACCCCCAA；CGAGAGCATCTTCACTGCTG，TGGTTTAAAATAGACGCGGG；TCCTGTCCTGAAAAGTGCAT，GGTGTCTGTTGAGGCACTGA；AGTTGGGATGTGGCAGTAGG，TGAGTGCTT GTGTGTGAGCA；试剂2包括产物长度分别为104bp、141bp、213bp、278bp的SSR引物，引物序列分别为ATCCGCTTCATCTCCAACAT，GGTGCAGTGAGAGTGTTTGC；CGGGGCAGAACTAAGACAAA，TTTGCAATGTGCAATGTGTTT；TGACGTGGCCAAGTATGGTA，GTTCGAGTCTCGGTACTGGC；AATTCTTCTCCAAGGGCTCC，TCGGTTAGACCAGAGAAAGCA；试剂3包括产物长度分别为114bp、154bp、204bp、248bp的SSR引物，引物序列分别为AACGTGTGTCTCTGGCACTG，ATGCGCAGTTTGTCCTGTAA；GCATTGTTGCTCTGCATGAT，CCTCCTCTTGTGTGTGGGAT；TTTTAGCAACCCCAAAATGC，CGCAGAGTCTCTCTCAACCC；CAGAAGTCTCTGTGTGGCATTT，TAAAAGTGTGAGGCCAGCAA。

作为本发明的进一步优化方案，引物序列三个均为5’→3’,正向引物在前，反向引物在后。

作为本发明的进一步优化方案，试剂1、试剂2和试剂3的浓度均为100μM/L，需要稀释十倍用于实验或者-20℃条件下保存。

作为本发明的进一步优化方案，试剂1、试剂2和试剂3中的引物试剂所需的退火温度为51-62℃。

作为本发明的进一步优化方案，所述的taq酶预混液购自诺唯赞公司。

需要使用试剂1、试剂2和试剂3这三支引物试剂分别对待测个体进行PCR。

使用该试剂盒进行PCR时体系为50μl，25μl Taq预混液，13μl蒸馏水，10μl引物试剂，2μl的DNA，容器为200μl EP管。

对样品进行短暂离心。放入PCR仪。

PCR反应程序设置：94℃预变性2min，94℃变性20s，51℃复性20s，72℃延伸25s，最终延伸4min，第二步到第四步进行27次循环。

对PCR产物进行聚丙烯凝胶酰胺电泳，使用质量分数6%-12%浓度的聚丙烯凝胶酰胺，1×TBE作为缓冲液。

电泳后，使用扫描仪对凝胶图进行扫描或者拍照，使用PHOTOSHOP的标尺或者尺子对每一条水平线上的PCR产物的条带进行比对和记录，在同一水平线上，有条带的记为1无条带的记为0。

最后使用SPSS或者NTsys 2.0对上述的记录进行聚类分析，得出结果。

由以上步骤可以看出，该试剂盒极大的减少了操作过程中的工作量，操作简便，将数种产物长度不同的SSR进行混合，极大的减少了操作过程中的工作量，PCR反应最快50分钟即可完成，电泳1个小时内完成，因此，该方法最快可在2个小时内对光倒刺鲃不同群体进行鉴定分类。

上述的Taq酶预混液购自诺唯赞生物公司。

本发明的有益效果是：

1、使用该试剂盒进行分类操作简便，将数种产物长度不同的SSR进行混合，极大的减少了操作过程中的工作量，更为准确，使用SSR分子标记，分类快速，最快可在2小时内分类一批个体。

附图说明

图1是对PCR产物进行聚丙烯凝胶酰胺电泳图；

图2是构建0,1矩阵示意图，B1表示所有SSR共跑出来的条带总数；C1表示的是材料数，D2缺失数值；

图3是聚类分析图；

图4是引物详细信息图（序列，长度，退火温度，引物名称等）。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明：

一种快速对光倒刺鲃不同群体进行分类的试剂盒，所述的试剂盒包括taq酶预混液、蒸馏水、引物，所述的引物包括试剂1、试剂2和试剂3，试剂1、试剂2和试剂3分别为含有4种SSR引物的混合试剂，试剂1包括产物长度分别为109bp、150bp、202bp、273bp的SSR的引物，引物序列分别为（引物序列三个均为5’→3’,正向引物在前，反向引物在后）CCTGTGAAATGATTCCATGC，CTTTGACGTAAAACCCCCAA；CGAGAGCATCTTCACTGCTG，TGGTTTAAAATAGACGCGGG；TCCTGTCCTGAAAAGTGCAT，GGTGTCTGTTGAGGCACTGA；AGTTGGGATGTGGCAGTAGG，TGAGTGCTT GTGTGTGAGCA；试剂2包括产物长度分别为104bp、 141bp、213bp、278bp的SSR引物，引物序列分别为ATCCGCTTCATCTCCAACAT，GGTGCAGTGAGAGTGTTTGC；CGGGGCAGAACTAAGACAAA，TTTGCAATGTGCAATGTGTTT；TGACGTGGCCAAGTATGGTA，GTTCGAGTCTCGGTACTGGC；AATTCTTCTCCAAGGGCTCC，TCGGTTAGACCAGAGAAAGCA；试剂3包括产物长度分别为114bp、154bp、204bp、248bp的SSR引物，引物序列分别为AACGTGTGTCTCTGGCACTG，ATGCGCAGTTTGTCCTGTAA；GCATTGTTGCTCTGCATGAT，CCTCCTCTTGTGTGTGGGAT；TTTTAGCAACCCCAAAATGC，CGCAGAGTCTCTCTCAACCC；CAGAAGTCTCTGTGTGGCATTT，TAAAAGTGTGAGGCCAGCAA。

试剂1、试剂2和试剂3中的引物试剂所需的退火温度为51-62℃（图4）。既保证引物与模板紧密结合也可保证引物的特异性，并且所有引物试剂可以在同一个PCR反应程序内进行，降低工作量。所述的taq酶预混液购自诺唯赞公司。

本发明采用10倍稀释该试剂盒的引物试剂，进行分类实验。

本次采用北江，长江以及北江与长江杂交光倒刺鲃各4尾进行实验，1-4为北江光倒刺鲃，5-8为长江光倒刺鲃，9-12为长江与北江杂交光倒刺鲃，使用这三支引物试剂分别对这些个体进行PCR。

实验PCR时体系为50μl，25μl Taq预混液，13μl蒸馏水，10μl的引物，2μl的DNA。

PCR反应程序设置：94℃预变性2min，94℃变形20s，51℃复性20s，72℃延伸25s，最终延伸4min，第二步到第四步进行27次循环。

对PCR产物进行聚丙烯凝胶酰胺电泳，使用12%浓度的聚丙烯凝酰胺。1×TBE作为缓冲液。并使用硝酸银染色，拍照或扫描（图1）。

1-9以及11-13泳道为北江群体，14-25泳道为长江群体，27-38泳道为北江与长江杂交群体，10泳道以及26泳道为PBR322marker。

1-4、14-17、27-30使用引物试剂1；5-8、18-21、31-34使用引物试剂2；9、11-13、22-25、35-38使用引物试剂3。

对每一个体PCR产物的条带进行记录，在同一水平线上，有条带的记为1无条带的记为0，构成0,1矩阵。

构建NTsys表格B1表示所有SSR共跑出来的条带总数；C1表示的是材料数，D2缺失数值（图2）。

最后使用NTsys 2.0进行聚类分析，得出结果（图3）。聚类分析图可知长江群体聚为一支，北江群体聚为一支，杂交种群聚为一支。

由上步骤可以看出，将数种产物长度不同的SSR进行混合，极大的减少了操作过程中的工作量，PCR反应最快50分钟即可完成，电泳最快1个小时内完成，因此，该方法最快可在2个小时内对光倒刺鲃不同群体进行鉴定分类。

最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。