一种利用整体原位杂交技术检测环境污染物发育毒性的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用整体原位杂交技术检测环境污染物发育毒性的方法。

背景技术：

斑马鱼是一种重要的模式生物，其基因与人类的基因相似度高达87％左右，用斑马鱼为实验材料得到的实验结果对人体具有重大借鉴意义；因此斑马鱼在毒理学研究中应用十分广泛，特别是斑马鱼的胚胎对化学品具有高度的毒性敏感性，能够检测出极低含量的有毒环境污染物的毒理作用。

斑马鱼在毒理学中的应用是近几年发展快速。为了鉴定环境污染物的毒性,我们需要分析斑马鱼毒理学终点和污染物剂量的相关性，确定其毒物作用动力学模式，从而阐明其毒理学机制。

关于环境污染物对鱼类早期发育影响的研究目前大都处于表型观察阶段，大部分实验主要通过斑马鱼的生长基本参数，比如死亡率、组织损伤程度和心包水肿等来研究其对斑马鱼早期的发育毒性作用。然而，这种方法具有一定的局限性。首先，生物体是一个有机的整体，从接触暴露物到身体做出反应，需要体内各器官共同协调作用，当暴露浓度超过生物体承受的极限后，才会表现出机体的损伤；其次，在日常生活中，人类往往是长期低剂量的接触环境污染物，以身体损伤为终点的暴露实验就需要很高的暴露浓度和较长的暴露时间，这样当把实验结果外推到人体上时，就会有很大的不确定性和不准确性。

技术实现要素：

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种利用整体原位杂交技术检测环境污染物发育毒性的方法。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供了一种检测环境污染物的方法，包括：采用整体原位杂交技术检测环境污染物对斑马鱼胚胎的发育毒性。

进一步地，所述方法包括：根据斑马鱼胚胎囊胚预定命运图(fate map)，选取斑马鱼囊胚预定命运基因作为生物标志基因，利用整胚原位杂交技术检测环境污染物对所述生物标志基因转录表达量变化的影响，进而检测环境污染物对斑马鱼胚胎的发育毒性。

本发明一实施例中，选取斑马鱼囊胚预定命运基因脊索中胚层标记基因ntl作为生物标志基因的代表进行了研究。但是，并不限于该斑马鱼囊胚预定命运基因脊索中胚层标记基因ntl。只要是选取斑马鱼囊胚预定命运关键基因作为生物标志基因均可，如标记血液发育相关基因fech、标记表皮层发育关键基因foxi1、标记脑发育关键标记基因cyp26a1、标记肌肉发育相关关键标记基因myod1和前脊索板(PCP)标记基因ssha等。

进一步地，所述方法包括：

(1)根据斑马鱼胚胎囊胚预定命运图，选取斑马鱼囊胚预定命运基因作为生物标志基因，并针对所述生物标志基因，提供杂交用反义RNA探针；

(2)将斑马鱼胚胎在环境污染物中进行暴露处理，固定与保存；

(3)将固定与保存后的斑马鱼胚胎进行整体原位杂交，检测生物标志基因表达量变化，获得环境污染物对斑马鱼胚胎的发育毒性。

优选地，步骤(2)中，进行整体原位杂交包括：

原位杂交第一天：复水、清洗、预杂交、反义RNA探针杂交；

原位杂交第二天：移出反义RNA探针、清洗、封闭、孵育抗体；

原位杂交第三天：移除抗体、清洗、显色、分析生物标志基因表达量变化。

优选地，步骤(2)中，反义RNA探针用于结合生物标志基因。

优选地，步骤(2)中，抗体用于结合反义RNA探针。

进一步地，所述环境污染物选自但不限于纳米银。

本发明的第二方面，提供了前述方法用于快速检测微量环境污染物的用途。

本发明的第三方面，提供了前述方法用于研究环境污染物作用模式的用途。

本发明的第四方面，提供了前述方法用于评价环境安全性的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

斑马鱼早期发育是一个动态过程，其毒性作用的外在表现需要一定的时间。随着胚胎囊胚预定命运图(fate map)的解析，利用斑马鱼的关键基因表达图式，进行毒性评价的方法可由表型的观察逐渐深入到分子表达图式水平上。利用胚胎囊胚预定命运图(fate map)，寻找合适的生物标志基因，有助于利用毒性通路的紊乱来评估化学物对人体的损害，识别并鉴定出生物体内有害结局路径(AOP)，确定毒性通路分子起始事件(MIE)，识别环境污染物毒性导致损伤的关键事件，预测环境污染物对斑马鱼器官、组织的潜在毒性作用，进一步揭示环境污染物的作用模式，缩短检测周期，真正实现早期预警的目的。

附图说明

图1斑马鱼胚胎30％外包期ntl基因纳米银0mg/L对照组，其中，30％外包期是指：外包运动开始时卵黄细胞的隆起，产生所谓的胚层，当胚层边缘达动-植物极距离的30％时，此时称为30％外包期。

图2斑马鱼胚胎30％外包期ntl基因纳米银10mg/L暴露组。

图3暴露于30mg/L纳米银组的斑马鱼胚胎30％外包期ntl基因表达情况。

图4斑马鱼胚胎30％外包期ntl基因纳米银90mg/L暴露组。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1

本实施例根据胚胎囊胚预定命运图(fate map)，选取斑马鱼囊胚预定命运基因脊索中胚层标记基因ntl作为生物标志基因，利用整胚原位杂交技术检测环境污染物(以纳米银为例)对生物标志基因ntl转录表达量变化的影响，来评价环境污染物(以纳米银为例)对斑马鱼早期器官、组织的潜在发育毒性作用。

一、杂交用RNA探针的制备：

1、总RNA提取：取约30mg野生型斑马鱼新鲜组织样品，加600μl Trizol充分研磨，室温裂解10min，加氯仿摇晃混匀室温静置10min抽提，12000rpm离心15min吸取上清液加异丙醇沉淀，12000rpm离心5min收集沉淀，然后用75％乙醇洗涤，离心去除乙醇室温晾干，加入30μl DEPC处理水溶解。

2、反转录获得cDNA：利用TakaRa反转录试剂盒，按试剂盒操作说明将提取的总RNA反转录得到cDNA。

3、DNA模板制备：

根据NCBI数据库所得ntl CDS区序列设计特异引物，具体地：

ntl-probe-t7-F：TAATACGACTCACTATAGGGACATCGAAGAACCGCGTA(SEQ ID NO.1)；

ntl-probe-R：ACGAATGTTTCCCGTGCTCA(SEQ ID NO.2)；

PCR扩增获得制备RNA探针的DNA模板，将PCR获得的目的片段连接到PMD19-T载体上，转化到大肠杆菌中，PCR检测挑取阳性克隆过夜培养，提质粒送测序，测序结果与数据库进行比对，验证序列正确性。

4、RNA探针转录模板制备：以质粒为模板，用特异引物ntl-probe-t7-F和ntl-probe-R扩增获得目的片段，PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化回收作为转录模板，浓度要求大于100ng/μl。

5、RNA探针制备：以步骤4所得PCR产物为模板，利用T7RNA转录试剂盒进行体外RNA转录，20μl转录体系(10×buffer 2μl、T7RNA polymerase 1μl、DNA模板1μg、Dig-NTP mix 1μl、加水至20μl)、37℃孵育3h，加DNA酶去除DNA模板，RNA纯化试剂盒纯化回收RNA探针。

ntl探针序列(SEQ ID NO.3)：

ACATCGAAGAACCGCGTAGGAACTGAGATGTCAGGCCACCTGTAATGGAGCCCGATGCTGAGCCTGATGGGGTGAGAGTCGTCCCTGCAACTGACCACAGACTTGGGTACTGACTGGTGTTGGAGGTAGTGTTTGTGGTGTGGGCCAGGGTTCCCATCCCGCTGGAGTTGGGGATCTGCAGGGCTGACCAGCTGTCATGAGACGCAAGACTTCCGGAAGAGTTGTCCATGTAGTTATTGGTGGTAGTGCTGCGGTGGGAGTAATGGCTGGGATATGGAGCAGCTCTGTGGTTCCTCAAGCTGGAGTATCTCTCACAGTACGAACCCGAGGAGTGAACAGGGGCCCCATTGAACTGAGGAGGGCTGCTGCTGGGGCCCATGGGGCCGTTACTGGGCAGGAACCAGCCACCGAGTTGTGAATATCCAGATTGCTGGTTGTCAGTGCTGTGGTCTGGGACTTCCTTGTGGTCACTTCTCTCTTTGGCATCGAGGAAAGCTTTGGCAAAAGGATTGTGTTTGATTTTCAGAGCGGTAATCTCTTCATTCTGATATGCTGTGACTGCAATAAACTGTGTCTCAGGAAAAGACTGACTGCTGATCATTTTCTGAATCCCACCGACTTTCACGATGTGTATCCTGGGTTCGTATTTGTGCAATGAGTTTAACATAATCTGTCCTCCTCCGTTGAGTTTATTGGAGAGTTTGACTTTGCTGAAAGATACGGGTGCTTTCATCCAGTGCGCGCCGAAGTTGGGTGAGTCCGGGTGGATGTAGACGCAGCTCGGGCTTTGGGGTTCGGGTTTCCCACCGGGCACCCATTCACCGTTCACGTATTTCCACCGATTATTATCGGCCGCCACAAAATCCAGCAGGACCGAGTACATTGCATTAGGGTCGAGACCGGTGACACTGGCTCTGAGCACGGGAAACATTCGT。

一是用RNA反转录得到的产物(cDNA)为模板，二是直接用cDNA为模板克隆(PCR)获得相应的DNA片段即目的基因，用试剂盒(酶切)回收纯化。

重组载体构建：将目的基因连接到PMD19-T载体中。

转化：-80℃冰箱取出感受态于冰上，加入连完PMD19-T载体的目的基因片段(重组载体)5μL，用枪头搅拌不要吹打，冰浴30min，再42℃水浴90s(1分30秒)，再冰浴2min。

超净台加入800μL LB，然后37℃,180r摇菌1h，取出5000rpm离心1min倒掉上清液剩余200μL混匀涂板，放入培养箱37℃培养。

单菌落克隆(菌落PCR)超净台操作10μL H₂O溶菌，加4μL模板(菌液)，菌落PCR跑出结果的把剩余6μL菌液，加5mL LB、5μLSmp摇菌过夜。

提取质粒扩PCR，凝胶电泳选出所需质粒进行测序，测序结果正确即构建质粒成功。

二、斑马鱼胚胎的获得，在环境污染物中的暴露处理，固定与保存

(1)分别将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度(0mg/L、10mg/L、30mg/L、90mg/L)的纳米银中，每个浓度设置三组平行样，其中，纳米银浓度为0mg/L的组作为对照组；各组均24h换一半液体，暴露处理24h后的胚胎需加入0.003％的1-苯基-2-硫脲(PTU)防止色素的生成，取所需时期的斑马鱼，未孵化出的斑马鱼胚胎需要去壳处理；

(2)将收集的斑马鱼胚胎用4％PFA室温摇晃固定2h或者4℃冰箱过夜；PBST室温摇晃清洗两次，一次5min；50％的Methanol/PBST室温摇晃清洗5min；Methanol室温摇晃清洗5min；换成新的Methanol保存于-20℃至少20min。

三、斑马鱼胚胎整胚原位杂交

1.原位杂交第一天：

(1)(75％、50％、25％)Methanol/PBST，逐步复水5min；

(2)PBST室温摇晃清洗两次，一次5min；

(3)10μg/mL蛋白酶K(现用现配)处理胚胎；1d胚胎处理0min，2d胚胎处理5min，3.5d胚胎处理18min，4d胚胎处理20min，8d胚胎处理45min；

(4)PBST室温摇晃清洗5min；4％PFA室温摇晃固定至少20min；PBST室温摇晃清洗两次，一次10min(同时预热杂交液)；

(5)旧的杂交液(无反义RNA探针)，60-68℃摇晃5min；换入新的杂交液(无反义RNA探针)预杂交，60-68℃摇晃至少90min(回收使用1次即旧杂交液)；

(6)预杂交期间将探针(反义RNA探针加杂交液1μg/mL)于68℃恒温培养箱变性20min，再冰上冷却2-3min；

(7)换上变性冷却后的探针60℃杂交摇晃过夜。

2.原位杂交第二天

(1)移出反义RNA探针回收，-20℃保存；

(2)50％的formamide/2×SSCT于65℃预热，60-68℃摇晃清洗清洗2次，一次30min；

(3)2×SSCT于65℃预热，60-68℃摇晃清洗3次，一次20min；

(4)0.2×SSCT于65℃预热，60-68℃摇晃清洗2次，一次30min；

(5)PBST室温摇晃清洗2次，一次5min；

(6)用封闭液(即blocking buffer)进行封闭至少1h慢速摇晃，现用现配。

3.洗脱和检测：

(1)吸走blocking buffer,加入1∶5000稀释的抗体anti-Digoxigenin-AP Fab Fragments(Roche),室温摇晃2h或4℃过夜；

(2)移除抗体，PBST室温摇晃清洗6次，一次20min；

(3)Buffer 9.5T室温摇晃清洗2次，一次10min。

(4)NBT/BCIP显色液室温避光显色；

(5)显色完成后用4％PFA室温摇晃固定至少20min；

(6)用PBST室温摇晃洗涤5min，3次；

(7)最后吸走PBST，加入90％甘油，4℃储存用于后续观察和拍照。

四、拍照侧视图和俯视图，结果如图1～4所示。根据斑马鱼囊胚预定命运基因脊索中胚层标记基因ntl表达量的变化判断环境污染物是否对斑马鱼早期发育有影响。

ntl是启动中胚层特化、促进中胚层细胞向背中线会聚的基因。该基因最初在所有预定中胚层细胞中表达，随后只在背部脊索中胚层细胞表达，调控脊索中胚层细胞的分化和脊索的形成。通过利用不同浓度梯度的环境污染物对胚胎进行暴露，然后通过原位杂交观察确定该污染物是否对ntl的表达有影响，进而判断该污染物是否对脊索发育有影响。图4所示，在90mg/ml的纳米银的暴露下，ntl基因的表达量明显降低，预示在此暴露浓度下，会对胚胎的脊索发育造成影响，必然会造成胚胎的发育畸形。斑马鱼胚胎发育至30％外包期时只需要5个小时，原位杂交时间是3天，因此可以在很短的时间里就可以判断该环境污染物是否对脊索发育有影响。对比现在常用统计斑马鱼的生长基本参数，比如死亡率、组织损伤程度和心包水肿等来研究其对斑马鱼早期的发育毒性作用方法，该方法大大缩减了检测时间，另外，不是所有的基因表达水平变化都会造成表型变化，因此，此种方法从基因水平上来检测污染物的毒性相应，增加了该方法的敏感性。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。