一种X染色体高密度探针定制的全基因组拷贝数检测芯片的制作方法

本发明涉及一种全基因组拷贝数检测芯片领域，具体的说涉及一种用于检测精神发育障碍患者拷贝数变异的全基因组芯片。
背景技术：
：精神发育障碍(或称神经发育障碍，neuro-developmentaldisorders，NDD)是儿科常见的一组疾患，包括精神发育迟滞、孤独症谱系障碍、学习困难、抽动症、注意力缺陷、多动障碍等多种精神发育障碍。NDD是由遗传和环境因素共同作用的结果，其中大约25-50％的NDD是有遗传因素引起的。在这些遗传因素中，有25-30％突变可能发生在X染色体上。同时临床研究报道支持NDD男性患者比女性多30％的观点，其原因在于男性仅有一条X染色体，基因处于半合子状态(hemizygote)，因此男性患者更容易发生暴露隐性基因变异，引发精神发育障碍性表型。在全基因内25000个功能基因中，参与精神心理发育调控的基因约1700个，在人类基因组中占6.8％，其中X染色体就有107个，占X染色体基因总数(818个)的13.1％。生物信息学分析发现人类X染色体基因在中枢神经系统中的表达量是其它组织中的2.8倍，进一步表明X染色体的相关基因在大脑正常发育和功能起着重要作用。生物信息学分析显示，从全基因组内考虑，X染色体上精神发育相关基因显著多于其他非X染色体(1.146个/Mb对比0.69个/Mb)，同时对于精神发育障碍儿童中，X染色体上基因组变异明显多于其他非X染色体。这些初步研究结果提示：对于精神发育障碍患者，尤其是男性精神发育障碍患者，应该首先或者必须筛查X染色体上基因变异。基因组拷贝数变异(copynumbervariants，CNVs)是由基因组发生重排而导致的，在人类基因组中广泛存在，从1bp(碱基对)到数百万bp范围内的缺失(deletion)、插入(insertion)、重复(duplication)等复杂多位点的变异。人类基因组CNVs的突变率较高，CNVs覆盖人类基因组全部核苷酸的35％，而单核苷酸多态性(SNP)所占比例却小于1％。CNVs可以是家系遗传，也可以是新发，其不仅对基因组适应性进化有促进作用，并且对孟德尔遗传、散发和复杂疾病的发生起到重要作用。既往研究发现，CNVs可以直接干扰基因或改变基因剂量来影响基因表达，从而引起一些特殊的遗传性疾病，例如微重复和微缺失的综合征。随着各类疾病的全基因组扫描研究相继铺开，发现CNVs与一系列人类疾病相关，是各类人类疾病，特别是精神发育类疾患发生的遗传基础。在精神发育迟滞患者中，15-20％的NDD患者携带罕见/新生致病性基因组CNVs,其中X染色体CNVs所引起的X连锁精神发育迟滞综合征(XLMR)患者占散发智障患者的10％-15％。因此，通过检测X染色体CNVs可以很大程度的提高精神发育障碍性疾病的诊断率。目前已有多种方法可用于CNVs的检测，传统的CNVs检测方法有FISH、MLPA、qPCR。这些技术虽在某种程度上能完成CNVs的检测，但距快速、高效、自动化的目标还相差甚远。DNA芯片技术是近年来新开发的一种基因检测工具。其原理是将大量的寡核苷酸探针有规律地排列在一张玻片上，这些探针可以与信号显示物质标记的样品DNA的扩增序列的互补序列进行相结合，通过对信号物质进行检测，对杂交结果进行计算机软件处理分析，从而获得杂交信号的强度及其分布模式图。基于寡核苷酸的全基因组芯片的方法为分析CNVs提供了一种高通量的技术，因此目前国外已经明确提出，对于NDD患者，尤其NDD儿童患者，应首先完成全基因组芯片检测，排除基因组CNV对疾病的致病性。近5年国内外各大医院都开展了基因组芯片的检验。但目前市场上的商业芯片存在一些弊端：由于芯片上探针数量的限制，目前市场上主流的60K芯片(芯片上探针数量约为60,000个)没能优先对疾病相关基因、X染色体上疾病相关重要基因进行探针设计，或者探针密度太低(现有常规芯片上的X染色体探针仅仅占全基因组的4.79％)，因此X染色体上的CNV筛查分辨率极低。这样导致一个重要问题：如果患者携带的致病性基因组CNV太小，采用普通基因组CNV芯片筛查时，就不能被检测出，报告给患者假阴性结果，从而延误诊断和诊断。虽然现在有些公司也开发了180K芯片(芯片上探针数量约为180,000个)，分辨率有所提高，但是对于X染色体上精神发育障碍相关基因的检测仍然没有针对性，且180K芯片价格昂贵，目前全基因组芯片属于自费项目，导致很多患者家庭无法承担此项检测费用，最终选择放弃。总体来说，目前的用于检测CNVs的芯片由于没有考虑X染色体在精神发育中的重要性，因此没有在X染色体开展探针设计，造成一些遗传病患者未能及时完成遗传诊断。本发明针对上述技术问题，开发了一种60K芯片，针对X染色体精神发育障碍相关基因进行探针高密度设计，能够高密度检测X染色体上的与精神发育障碍相关的基因(分辨率可达1kb)；并且，在非X染色体上进行低密度设计，使其能够同时检测非X染色体上的与精神发育障碍相关的基因(分辨率可达500kb)。与常规180K芯片相比，本发明芯片上探针数量减少了120K，价格也大大降低，在临床上具有更高的可操作性，价格也就易于被患者家庭所接受，具有很高的经济实用性。技术实现要素：本发明的目的是提供一种X染色体高密度探针定制的全基因组拷贝数检测芯片，能够高密度检测X染色体上的与精神发育障碍相关的基因。本发明的基因芯片灵敏度高，特异性和可靠性高，可科学用于筛查精神发育障碍患儿的遗传病因，为临床不明原因精神发育障碍儿童，特别是男童提供基因诊断，从而提高该病的诊断率，为该病的预后及遗传咨询提供可靠信息。为达到上述目的，本发明提供一种X染色体高密度探针定制的全基因组拷贝数检测芯片，在所述本发明基因芯片中，既在非X染色体上对疾病相关基因进行探针设计，同时对X染色体的探针进行详尽、专业的优化，对其中90个重要疾病相关基因进行高密度探针设计，使得普通商业芯片无法筛查出的致病性基因组变异，通过本发明芯片能够筛查出来，提高了医院或者医生对该疾病的基因诊断能力。具体的，本发明提供一种X染色体高密度探针定制的全基因组拷贝数检测芯片，所述芯片包含的检测X染色体的探针数量占全部探针数量的30％-40％。进一步的，本发明提供一种X染色体高密度探针定制的全基因组拷贝数检测芯片，所述芯片包含检测下述90个基因的探针：ABCD1、ACSL4、AFF2、AP1S2、ARHGEF9、ARX、ATP7A、ATRX、AVPR2、BCOR、BRWD3、CASK、CDKL5、CUL4B、DCX、DKC1、DLG3、DMD、EIF2S3、FANCB、FGD1、FLNA、FMR1、FTSJ1、GDI1、GK、GPC3、GRIA3、HCCS、HDAC6、HDAC8、HPRT1、HSD17B10、HUWE1、IDS、IGBP1、IKBKG、IL1RAPL1、KDM5C、KIAA2022、L1CAM、LAMP2、LAS1L、MAOA、MBTPS2、MECP2、MED12、MID1、MTM1、NAA10、NDP、NDUFA1、NHS、NLGN3、NLGN4X、NSDHL、OCRL、OFD1、OPHN1、OTC、PAK3、PCDH19、PDHA1、PGK1、PHF6、PHF8、PLP1、PORCN、PQBP1、PRPS1、RAB39B、RAB40AL、RBM10、RPL10、RPS6KA3、SHROOM4、SLC16A2、SLC6A8、SLC9A6、SMC1A、SMS、SOX3、SYN1、SYP、TIMM8A、TSPAN7、UBE2A、UPF3B、ZDHHC9和ZNF711；上述90个基因为X染色体上与精神发育障碍相关的重要基因。优选的，本发明所述芯片包含的检测上述90个基因的探针数量占全部探针数量的25％-40％，优选为约30％。更进一步的，本发明提供一种X染色体高密度探针定制的全基因组拷贝数检测芯片，所述芯片包含检测实施例表1中所述的1502个外显子的探针(其中chrX表示X染色体，数字区间表示基因组确切位置)。上述1502个外显子为X染色体上与精神发育障碍相关的90个重要基因的外显子。优选的，本发明所述芯片包含的检测上述1502个外显子的探针数量占全部探针数量的10％以上，优选10％-20％。更优选的，本发明所述芯片包含的检测上述1502个外显子的探针中，大于98％的外显子有至少2个探针，大于88％的外显子有至少3个探针，大于69％的外显子有至少4个探针，大于44％的外显子有至少5个探针。更进一步的，本发明所述基因芯片还包含固相载体，所述固相载体选自玻片、金属片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纤维膜、尼龙膜中的一种或多种。另一方面，本发明还提供了一种所述基因芯片在检测精神发育障碍患者的拷贝数变异中的用途。本发明的有益效果是：本发明基因芯片中设计的探针既分布于全基因组，又能高密度的分布于X染色体上，并且探针又相对集中在X染色体上精神发育障碍相关的90个基因上，该芯片既可以筛查非X染色体上大于500kb疾病相关基因组CNVs，还可筛查X染色体的单基因、甚至单外显子CNVs，可以更广泛更有效的筛查出患者的致病基因，使得普通商业芯片无法筛查出的致病性基因组变异，通过该芯片能够筛查出来，提高了医院或者医生对该疾病的基因诊断能力。并且该基因芯片自动化程度高，便于推广应用，适应于不同层次医院的需要。附图说明图1：本发明基因芯片的杂交信号图。图2：利用现有180K芯片和本发明基因芯片检测MECP2微重复综合征的对比图。图3：利用现有180K芯片和本发明基因芯片检测16p11.2微缺失综合征的对比图具体实施方式下面实施例对本发明进一步详细说明，本领域技术人员应当意识到在不脱离本发明的范围和精神的情况下所作的改动，均属于本发明的范围。实施例1：本发明芯片的设计原理和制备步骤1、芯片探针设计：首先在全基因内平铺探针库(https://earray.chem.agilent.com/suredesign/)中的30000个探针，此时X染色体上仅有2509个探针。之后，针对X染色体上的90个重要疾病相关基因增设18837个探针，具体设计为：先对X染色体的90个基因先平铺10000个探针，然后挑选出90个基因的1502个外显子区域和其旁边区域200bp(左右各100bp)设计9712个探针，其中，大于98％的外显子设计有至少2个探针，大于88％的外显子设计有至少3个探针，大于69％的外显子设计有至少4个探针，大于44％的外显子设计有至少5个探针(具体探针设计区域见下表1)，最后剔出重复探针，共18837个探针；同时设计重复探针5000个，对照探针5580个，共59417个探针。最后，根据上述挑选出的基因序列，通过本领域技术人员公知的、通用的方法确定探针序列并合成。本实施例芯片中探针所对应的90个基因的1502个外显子区域和探针数量见下表1：表1本实施例芯片中针对90个重要疾病相关基因的1502个外显子的探针设计区域和数目可以看出，本实施例芯片的探针设计与常规芯片显著不同。以常规的60K芯片为例，在全基因组约60000个探针中，X染色体上探针数量一般为2874个，占4.79％；上述90个重要疾病相关基因的探针数量一般为301个，占0.5％；而所述90个重要疾病相关基因的外显子的探针数量则更少，无法统计比例。而在本发明的60K芯片中，X染色体上探针数量为21346个，占35.9％，而90个重要疾病相关基因的探针数量为18837个，占31.7％，其中90个重要疾病相关基因的1502个外显子的探针数量为9712个，占16.3％。由此可见，本发明所述的全基因组芯片，由于在X染色体上重要基因设计了高密度探针，对于筛查致病性X染色体基因组CNV的工作中具有绝对优势。2、芯片制备步骤：(1)芯片载体的处理：载玻片用铬酸洗液洗涤，浸泡过夜，水洗，24wt％氨水浸泡过夜，水洗，然后浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95％(v/v)乙醇溶液中，用冰醋酸调节pH值至4.0，95％(v/v)乙醇超声清洗，150℃烘干4小时，9％(v/v)戊二醛醛基化处理。(2)基因芯片的制备及后处理：根据步骤1设计的探针序列，通过本领域技术人员公知的方法制备得到每条探针，然后将每条探针分别用点样液稀释至终浓度为50μM/L，所述的点样液为750mmol/L氯化钠，75mmol/L乙酸钠，5％(v/v)甘油，1wt％聚蔗糖和0.1wt％十二烷基黄酸钠溶液，并于96孔板中与浓度为200mmol/L的PBS溶液(含0.05wt％SDS)等体积混合后，通过接触式点样或喷墨式点样，根据基因芯片探针排布示意图点载到芯片载体上，每点点样体积约为0.5nL，点心间距为500μm，点直径约为200μm，每条探针重复点样2次，点样完毕后，室温放置24小时固相化即得基因芯片。实施例2：本发明芯片的检测实施例(1)待检样本的全基因组DNA抽提：可按照本领域常规方法进行提取，样本可为人静脉抗凝血液，本发明采用商业DNA提取试剂盒(Qiagen，QIAampDNABloodMiniKit，CatNo.51104)进行全基因组DNA提取；利用Nanodrop2000、Qubit2.0进行DNA质量和浓度检测。(2)对照样本和待检样本的消化(Agilent，SureTagDNALabelingKit，CatNo.5190-3399)：待检样本和对照样本各取0.2-0.5ug基因组DNA，放置不同的Ep管中，加水稀释至10.1ul，对照样本与待检样本性别一致(对照样本Agilent，CatNo.5190-4370、5190-4371)，按照2.9ul体系加入以下混合酶切消化液(包括限制性内切酶AluI和RsaI等)，37℃消化2小时，65℃孵育20分钟，4℃10分钟，确保内切酶失活。组分每个体系(ul)16.2个反应体系(ul)水117.8210倍缓冲液1.321.06BSA0.11.62Alu0.254.05Rsa0.254.05总计2.948.6(3)荧光素标记：从4℃取出消化后的样本，每个Ep管中加入2.5ul随机引物，迅速95℃变性3分钟，冰上放置5分钟，然后迅速按照9.5ul体系加入以下混合标记液(包括荧光素、标记酶等)，37℃消化2小时，之后65℃孵育10分钟，4℃10分钟，确保内切酶失活。(4)纯化和杂交：从4℃取出荧光标记后的样本，分别加入430ulTE溶液混合，混匀后用商业纯化试剂盒(SureTagDNALabelingKitPurificationColumns，CatNo.5190-3391)完成纯化，14000g离心10分钟，弃液体，再次加入480ulTE，17000g离心12分钟，弃液体，将收集管倒置于新的Ep管中，1000g离心1分钟，保存收集液并重新测定吸光度值，分别取8-11ugDNA，将对照样本和待检样本混合，按照9.5ul体系加入以下混合杂交液，95℃变性3分钟，37℃孵育30分钟，4℃10分钟，确保内切酶失活。组分每个体系(ul)10个反应体系rxn(ul)10倍封闭液4.5452倍HIRPM缓冲液22.5225总计27270(5)芯片上样和孵育：将每8个待检样本上样到一张芯片上。放入杂交炉(SHELDON，ModelNo.G2545A)，67℃孵育24-40小时。(6)洗芯片：预先将洗液2盒子放置在37℃水浴锅内过夜预热，从杂交炉内取出芯片，用洗液1初洗，去除剩余杂交液，然后放置在洗液1盒子内，充分清洗5分钟，然后迅速放置到预热的洗液2盒子，清洗1分钟。迅速取出确保芯片未沾有液体。(7)芯片数据扫描：启动芯片扫描仪(Agilent，DNAMicroarrayScanner)，将芯片放置扫描仪内置盒内，启动电脑中扫描仪程序，开始扫描。(8)从扫描仪中获得原始杂交信号，利用FeatureExtract软件抽提杂交信号，并转变为基因组位置和杂交比值，进入数据分析程序。从图片1可见，左上角的图是阵列四角点阵图，图片中上下左右各有2，4，3，5个对照探针信号，对照探针能正常显示，说明此次实验成功。左下角红绿杂交信号柱形图(上图是红色，下图是绿色)，这两张图表示红绿杂交信号均衡。右上角图显示红绿信号数值接近，都达到“优质”(第1、2、3、7、11行)或“好”(第4、6、8、10、12、13行)，说明红绿荧光杂交无偏差，荧光强弱能真实反应基因组拷贝数目。右下角显示红绿色信号具有明显正相关，说明整体基因组结构正常。实施例3：本发明芯片与现有芯片的两个对比检测实施例1.MECP2微重复综合征利用现有SurePrintG3180K芯片(Agilent,Cat.G4884A)和本发明实施例的芯片按照实施例2的方法分别检测MECP2微重复综合征患者的DNA样本。从图2可见，在本发明芯片的检测结果中，在Xq28区域可以明显看到一个异常高峰(在虚线处)，该异常高峰的位置和180K位置基本一致，但其峰值明显高于180K芯片。实验结果证实了本发明的60K芯片能准确检测出MECP2微重复综合征。由于60K芯片的价格要低于商业180K芯片，如果使用该定制60芯片，将减少患者家庭所承受的经济压力，但对一些致病性CNV，两者的检出率并无差异。2.16p11.2微缺失综合征利用现有SurePrintG3180K芯片(Agilent,Cat.G4884A)和本发明实施例的芯片按照实施例2的方法分别检测16p11.2微缺失综合征患者的DNA样本。从图3可见，在本发明芯片的检测结果中，在16p11.2区域可以明显看到一个异常低峰(下凹的灰色条带)，该区域大小和180K芯片中异常低峰基本一致。实验结果证实了本发明的60K芯片不仅能够不仅可以检测出X染色体的微小基因组失衡，还可以检测非X染色体的基因组微失衡。因此避免患者为完成诊断而多次采样，多次检测，同时也减少了检测费用。综上所述，本发明提供了一种适宜检测精神发育障碍疾患致病基因变异的全基因组60K芯片，和规格相同的60K芯片相比，该设计芯片能筛查出更微观，更细小的致精神发育障碍的基因变异，因此具有较强的实际应用价值。当前第1页1 2 3