两个高油酸油菜鉴别基因及其筛选方法和应用与流程

本发明属于生物技术领域，涉及高油酸油菜的育种，具体涉及两个高油酸油菜鉴别基因及其筛选方法和应用。

背景技术：

高油酸菜油有很好的营养保健功能，其营养价值可与橄榄油、茶油相媲美，因而其大规模推广对于油菜产业的优化升级及改善我国人民的食用油水平有很重要的作用。同时，也可增加油菜种植户的效益，有效增加油菜生产，促进我国油菜产业的大规模发展，保障我国食用油安全。

目前国内外虽然选育出一些品种，但仍难以满足日益增长的大量需求，究其原因主要是高油酸油菜新品种选育多通过杂交或定向选育技术获得材料，在田间种植，成熟后利用气相色谱仪对收获的种子进行分析，根据结果确定其是否为高油酸材料。该方法耗时久(每年仅一季)，且田间工作管理及后期分析检测工作较为繁重，新品种选育难度大；同时，还需投入大量的人力资源，增加了育种成本，不利于新品种大规模推广；因此采用一种简单、快速的筛选方法来确定高油酸油菜材料成为当前高油酸油菜育种研究的关键。

早期筛选高油酸油菜育种材料的研究中，如王敬乔等通过观察置于含有次氯酸钠和吐温的混合溶液中叶片氧化变白的快慢在早期阶段鉴别高油酸突变体。高建芹等发现除花期外，各生育期营养器官与生殖器官中的油酸相对含量呈极显著正相关。Noelle A等通过利用实时荧光定量PCR方法检测高油酸花生及其野生型种子和叶片中FAD2基因表达量快速检测高油酸花生基因型。这些方法可减少育种中的繁琐工作，但没有进行系统的研究及后续验证，因此难以在生产中应用。

技术实现要素：

本发明为解决油菜育种中工作繁琐，育种周期长的技术问题，提供了两个高油酸油菜鉴别基因及其筛选方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

两种高油酸油菜鉴别基因，所述高油酸油菜鉴别基因1为atpB基因，其序列如SEQ ID NO：1所述；所述高油酸油菜鉴别基因2为肌酸磷酸激酶基因，其序列如SEQ ID NO：2所述。

两个高油酸油菜鉴别基因的筛选方法，步骤如下：

(1)根据转录组分析，筛选高油酸油菜育种材料早期筛选的候选基因；

(2)采集油酸含量不同的不同生育期油菜材料，测定候选基因的差异表达量；

(3)通过气相色谱法测定步骤(2)中油菜成熟种子的脂肪酸成分；

(4)将步骤(2)中的差异表达量与步骤(3)中的脂肪酸成分进行对比，筛选高油酸油菜基因。

两个高油酸油菜鉴别基因的筛选方法作为筛选高油酸油菜育种材料的应用。

本发明的有益效果在于：

1.在油菜育种材料营养生长期进行有效筛选，减少大量繁琐的后期田间管理及分析检测工作，降低育种成本。

2.对大量未知材料进行筛选，获得大批有高油酸潜力的育种材料，进行后期研究，加快育种进程，促进高油酸油菜新品种选育。

附图说明

图1为atpB基因在高油酸油菜和低油酸油菜中不同时期的表达量。

图2为肌酸磷酸激酶基因在高油酸油菜和低油酸油菜中不同时期的表达量。

图3为atpB基因在不同油酸含量的油菜中的表达量。

图4为肌酸磷酸激酶基因在不同油酸含量的油菜中的表达量。

图5为atpB基因在杂交种子出苗7天中的表达量。

图6为atpB基因在杂交种子5-6叶期的表达量。

图7为atpB基因在杂交种子越冬期的表达量。

图8为肌酸磷酸激酶基因在杂交种子出苗7天中的表达量。

图9为肌酸磷酸激酶基因在杂交种子5-6叶期的表达量。

图10为肌酸磷酸激酶基因在杂交种子越冬期的表达量。

具体实施方式

1.材料准备

高油酸油菜材料、湘油15及不同油酸含量材料均由国家油料改良中心湖南分中心提供。

2.试验方法

2.1定量PCR检测

样品制备：在出苗后7d取10株，5-6叶期(12月初)和越冬期(元旦左右)各取10株油菜嫩叶(1片/株)备用，花期(3月中旬)各取10株自交套袋的花(3朵/株)，在授粉后20-35d(4月中旬)各取10株自交的未成熟种子(0.5g/株)及其角果皮(3个/株)混合保存于-80℃。

RNA提取：提取总RNA采用TransZol Up Plus RNA Kit(Trans GeneBiotech)，具体方法参照说明书。经Nanodrop 2000微量紫外分光光度计(Thermo)及琼脂糖凝胶电泳检测符合要求，保存于-80℃备用。

定量PCR分析：

(1)根据转录组结果(由华大基因代为进行)分析，两个基因不同生育期材料中表达情况分析；

(2)两个基因在56％、65％、75％和81％油菜5-6叶期叶片中表达情况分析，结果如图3所示；

(3)高油酸材料(油酸含量81.4％)和湘油15(油酸含量62.5％)杂交后代不同生育期的差异基因表达情况分析。

逆转录反应采用TransScript All-in-One First-Strand cDNA(Trans GeneBiotech)，具体方法参照说明书。引物采用Primer 5.0设计，由上海生工技术公司合成。使用CFX96TM Real-Time System(BIO-RAD,USA)采用两步循环法进行实时荧光定量PCR反应，反应荧光信号通过CFX manager software program进行信号收集和分析。反应条件为：95℃预变性30s,随后进入40个循环，每个循环中95℃变性5s，最后60℃退火30s，72℃延伸15s。UBC21(ubiquitin-conjugating enzyme 21)作为内参基因，上游引物序列如SEQ ID NO：7所示，下游引物序列如SEQ ID NO：8所示。基因表达情况采用比较周期阈值法进行评。数据分析采用ANOVA和Post Hoc test，p值<0.05表示存在显著差异。

2.2油菜种子品质分析

实验仪器：SP-6890型气相色谱仪、FID检测器和N3000色谱工作站毛细管色谱柱DB-23(安捷伦科技有限公司)；AL204电子天平(梅特勒-托利多国际股份有限公司)。

色谱条件：进样口温度270℃；柱温190℃；以5℃/min升至230℃，保持1min；检测器温度260℃；氮气流量250mL·min^-1；氢气流量30mL·min^-1；空气流量300mL·min^-1；分流比40：1；柱流量1.0mL·min^-1；进样量：1.0μL。

样品制备与测定：取0.2g种子烘干，用高速粉碎机粉碎，置于10mL带塞试管中，再加入2mL体积比为1：1的乙醚-石油醚加入到10mL试管中，加入1mL 0.5M的KOH-甲醇做催化剂，将试管置于40℃的恒温水浴中，反应24h后，静止分层，从上层取样。

3.结果与分析

3.1两个基因不同生育期材料中表达情况分析

采集油酸含量不同的油菜不同生育期材料，并测定候选差异基因表达量；atpB基因的表达量以引物对SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4进行荧光定量PCR结果如图1所示；肌酸磷酸激酶基因的表达量以引物对SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6进行进行荧光定量PCR结果如图2所示。根据结果可知，这2个基因在油菜营养生长期(花期前)表达有明显规律，可用于进一步研究。

3.2两个基因在56％、65％、75％和81％油菜5-6叶期叶片中表达情况分析

采集油酸含量为56％、65％、75％和81％的油菜5-6叶期叶片，并测定候选差异基因表达量；atpB基因的表达量以引物对SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4进行荧光定量PCR结果如图3所示；肌酸磷酸激酶基因的表达量以引物对SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6进行进行荧光定量PCR结果如图4所示。根据结果可知，这2个基因在不同油酸含量油菜5-6叶期叶片中表达情况比较与油酸含量间有明显关联，可根据基因表达情况预测油菜油酸含量。

3.3高油酸材料(油酸含量81.4％)和湘油15(油酸含量62.5％)杂交后代基因表达情况分析

采集杂交后代不同出苗后7d、5-6叶期和越冬期材料，并测定候选差异基因表达量；atpB基因的表达量以引物对SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4进行荧光定量PCR结果如图5-7所示；肌酸磷酸激酶基因的表达量以引物对SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6进行进行荧光定量PCR结果如图8-10所示。

3.4高油酸材料(油酸含量81.4％)和湘油15(油酸含量62.5％)杂交后代品质分析

采用气相色谱法测定杂交后代成熟种子的脂肪酸成分，具体方法参照2.2，结果如表1，由上述结果可知，杂交后代主要分布在60-63、69-73和78-82三个区域，其中69-76区域最多，约占50％，符合孟德尔分离规律。

21个杂交后代种子油酸含量(湘油15油酸含量62.1％，高油酸油菜种子油酸含量80.5％)

表1

对比基因表达结果可知，这2个基因在不同杂交后代营养生长期表达情况比较与油酸含量间有明显关联，可用于早期筛选高油酸油菜育种材料。

3.5结果

最终确定atpB基因和肌酸磷酸激酶基因可用于高油酸油菜育种材料早期筛选，筛选出的atpB基因，其基因序列如SEQ ID NO：1所示，该基因表达的酶分别位于类囊体膜、质膜或线粒体内膜上，参与氧化磷酸化与光合磷酸化反应，具有氧化磷酸化、光和系统电子转移等作用，在跨膜质子动力势的推动下催化合成生物体的能量“通货”——ATP。

肌酸磷酸激酶基因，其基因序列如SEQ ID NO：2所示，在代谢(碳代谢、碳水化合物代谢、能量代谢)、转运(含磷基团、成对受体磷集团转运、磷酸激酶)等生理过程中发挥着重大作用。