一株对蛴螬幼虫高致病力的球孢白僵菌菌株及其应用的制作方法

本发明属于害虫生物防治领域，涉及一株球孢白僵菌及其应用，具体涉及一株对蛴螬具有高致病力的球孢白僵菌及其应用。

背景技术：

蛴螬,为鞘翅目金龟甲的幼虫，别名核桃虫、白土蚕，是国内外公认难于测报和防治的重大土栖性害虫。其种类多达30000余种,我国目前已记录约1800种,植物地下部受害的86%是由蛴螬造成。

蛴螬食性杂、食量大，栖息于地下，具有隐蔽性和滞后性，时常造成根茎严重受损，植株萎蔫死亡，农作物减产甚至绝收。近几年随着种植结构调整和大面积保护性耕作体制的快速发展，许多地区的蛴螬虫口密度不断上升，危害程度加重，为害规律有所改变，为害损失逐年加剧。由于蛴螬的生物习性和生活环境特点，使化学农药的施用和防治效果受到限制，而且频繁使用化学农药造成的残留问题、环境污染问题已引起各界人士担忧。因此，防治蛴螬的难度比较大。

目前，对于蛴螬的防治主要采用物理、化学和生物防治。在物理防治上，可采用灯光诱捕成虫、翻耕拾捡幼虫、适时浇水处理等措施，不但浪费劳动力，且见效慢。在化学防治上，曹耿全等人（蛴螬对花生的为害特点及防治措施.安徽农学通报,2004，10（2）:66）一直主要依靠化学杀虫剂辛硫磷，多属于中高毒性，以直接灌溉或药剂拌撒的方式进行防治，不但在土壤渗透过程中有许多不确定的因素，造成投入成本高、污染环境的问题，而且出现蛴螬产生抗药性、作物产品农药残留超标等问题。在生物防治上，利用昆虫病原真菌可作为控制花生蛴螬的安全方法和有效途径，张冰等人（绿僵菌防治高尔夫草坪蛴螬试验[J].草业科学，2008，（11）：125-128）利用绿僵菌分生孢子对蛴螬进行防治,但是由于防治效果的不稳定性和缓效性,而限制了它的广泛应用。宋益良等人（吉林乳状菌的分离与防治大黑金龟幼虫试验初报[J]．吉林农业科学，1983，2:64-68）报道了利用乳状菌对蛴螬进行防治，由于环境因素影响，乳状菌对蛴螬的致病作用非常缓慢，通常需要几个月或一年以上，效果并不明显。

目前虽然已有一些关于绿僵菌菌株的筛选和田间防治效果的报道，其稳定性和时效性较差。但利用球孢白僵菌对蛴螬进行防治的报道很少，缺乏一种稳定优良性状的白僵菌菌株，严重影响了农业生产的效益和农作物的产业化推进。此外，白僵菌具有易培养、易储藏、施用简便等优点，而且在土壤中的存活时间较长，用它防治地下害虫，不仅在防治期间效果明显，而且残效期长，所以利用白僵菌来控制地下害虫危害的潜力很大。因此，筛选对蛴螬高致病力的球孢白僵菌菌株是一项重要的基础研究工作，使之能够在土壤中存活定殖并融入生态环境中，建立起可持续控制蛴螬的生态机制。

技术实现要素：

为了克服缺乏优良的白僵菌菌株而限制了对蛴螬的生物防治，本发明的首要目的是提供一株对蛴螬具有高致病力的球孢白僵菌菌株。

本发明的另一目的在于提供上述球孢白僵菌菌株在防治蛴螬方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株对蛴螬具有高致病力的球孢白僵菌菌株菌株为球孢白僵菌（Beauveria bassiana）BbQLU1，已于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号：CGMCC NO.11618。

该球孢白僵菌菌株BbQLU1具有以下特征：

在SDAY培养基上25～28℃条件下生长4～5天，菌落的平均直径17mm,16天后达到65mm。菌落初期为乳白色绒毛状，后期有淡黄色粉状孢子层呈中心凸起状态。分生孢子多数近似为球形，少数为卵圆形，透明光滑，平均大小为2.67（2.26～4.38）×1.86（1.54～2.49）μm。

本发明所提供的或所述的菌剂可用于防治蛴螬幼虫。

本发明所提供球孢白僵菌（Beauveria bassiana）BbQLU1对蛴螬幼虫具有较强的侵染致病能力。实验室采用体壁侵染的方法，将一组30～40头一龄蛴螬幼虫在30ml 10⁸个孢子/ml的悬液中浸渍10s，并以0.02%吐温-80的浸渍作为空白对照。每组幼虫置于直径15cm的大号培养皿中，在25℃和12:12h条件下保持50天，每隔一天观察记录死亡数，各处理重复3次。统计培养期间处理组和对照组蛴螬的累计死亡数量，计算半致死时间LT_5O，评估防治效果。

本发明的优势在于：本发明提供了一株对蛴螬幼虫具有高致病力的球孢白僵菌菌株及其应用，对防治蛴螬幼虫提供了一种生物防治资源。同时利用白僵菌进行生物防治具有安全可靠、无污染、药性持久、致病力强的特点，利用白僵菌幼虫，解决了用化学方法防治蛴螬产生的农药残留、环境污染等问题，具有良好的开发潜力和生产价值。

附图说明

图1是本发明球孢白僵菌（Beauveria bassiana）分子鉴定的N-J系统发生树结构示意图。

图2是蛴螬被球孢白僵菌（Beauveria bassiana）BbQLU1的感染状。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的试剂、材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中的SADY培养基为萨氏培养基，其具体配方为葡萄糖40g，琼脂20g，酵母浸膏10g，水1000ml。

实施例1球孢白僵菌BbQLU1的鉴定

1.1分离纯化

本次采用的分离方法是僵虫分离法。从山东省农科院长清科研基地采集到的蛴螬僵虫放在灭菌的培养皿中，经0.1%升汞酒精（用95%的酒精1000ml溶解1g升汞）表面消毒3～4min，再用无菌水洗涤三次，将消毒的僵虫放置于SDAY平板的培养基的中央，在26℃恒温培养箱中培养10～14天，将其体表的白粉状物轻轻抖落到盛有0.1%的吐温-80的水溶液的三角瓶中，用磁力搅拌子剧烈震荡使白僵菌分生孢子单个分开。将孢子悬浮液进行梯度稀释，利用移液枪吸取少量菌液滴到SDAY培养基平板上，并利用涂布器均匀涂布，置于26～28℃恒温培养箱中培养。

当在培养基上长出单个纯白色的菌落，及时用接种环挑出并及时转到另一个灭菌的SDAY培养基平板上，继续培养观察并没有其他杂菌侵染，纯化培养即完成。

1.2形态学鉴定

将分离纯化的球孢白僵菌菌株在直径为90mm平板SADY培养基上于上25～28℃条件下培养，3～4天后从平板上挑取白色菌丝制片在显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子的形态；12天后挑取成熟的分生孢子制片观察分生孢子的形态与大小。14～16天观察记录菌落的形态特征。菌落初期为乳白色绒毛状，后期有淡黄色的粉状的孢子层呈中心凸起状态。菌丝呈簇状生长，有分枝，无色光滑；在后期由于营养缺乏等各种限制条件，细胞均生于对称成直角的茸状产孢细胞顶端，分生孢子梗呈直角分支聚团成簇。分生孢子多数近似为球形，少数为卵圆形，透明，光滑，平均大小为2.67（2.26～4.38）×1.86（1.54～2.49）um。

1.3菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子测定

将分离纯化的5种菌株分别制成孢子悬液，分别接种于SDAY平板表面的玻璃纸上，于25℃下培养3～4天后收获菌丝，参照Raeder&Broda(1985)的方法提取DNA，步骤如下：

称取1g鲜菌丝置于预冷研钵中，液氮研磨至粉末。加入4mL DNA提取液[0.2M Tris·HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,10mM EDTA,1%SDS]，继续研磨后转移至离心管，冰浴3～5min。加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合液，剧烈震荡3min，4℃下1840g离心10min。吸取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液，颠倒混匀后于4℃下1200g离心10min。吸取上清液，加入1/10体积3M NaAC缓冲液(pH 5.3)和2.5倍体积乙醇，混匀后在-20℃下沉淀1h。4℃下10000g离心10min，弃上清后再用0.5mL 75%乙醇洗涤沉淀，再4℃下9300g离心5min。自然干燥3～5min后，加入0.6mL无菌水溶解，再加入2μL RNAase，在37℃下保温15min。重复一轮酚/氯仿抽提，最后用0.2mL无菌水溶解DNA。

白僵菌样品DNA-ITS区域PCR扩增：PCR扩增体系为25μl:其中上述提取的DNA 1.0μl;委托公司合成真菌ITS区通用引物ITS-4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS-5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）各1.0μl；2×Taq PCR MasterMix(含染料)12.5μl；ddH2O 9.5μl。

PCR反应程序：95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸40s，进行35个循环，最后72℃延伸7min，用无菌水代替模板作为阴性对照。

PCR产物经过电泳条带检测后确认样品DNA-ITS区域PCR扩增产物符合测序要求后。将PCR扩增产物进行连接、转化之后，送到铂尚生物技术（上海）有限公司进行序列测定。将测定的结果与NCBI基因数据库的白僵菌菌株序列进行比对。

测序结果与NCBI基因数据库比对表明：经引物ITS4单项引物测序的结果显示分离的5株白僵菌核糖体DNA-ITS的长度为560-581bp,其中BbQLU1菌株DNA-ITS碱基序列为572bp,与NCBI数据库的5株球孢白僵菌的同源性达99.21%。因此，BbQLU1为球孢白僵菌菌株（Beauveria bassiana）。

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）BbQLU1，已于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），登记入册编号为：CGMCC NO.11618。

实施例2球孢白僵菌BbQLU1的生物学特性

2.1营养生长速率的测定

将球孢白僵菌BbQLU1采用十倍稀释法涂布于贴有玻璃纸SDAY平板培养基上，25～28℃和12:12(L:D)h条件下在培养箱中培养，用十字交叉法每天测量1次菌落的直径，每处理设3个重复，共观察15天。

表1球孢白僵菌BbQLU1的生长速率测定

由表1可见，球孢白僵菌BbQLU1的菌落的生长比较快，9天后菌落的平均直径为26mm，15天菌落的直径达67mm。

2.2产孢量测定

将培养好的100μl分生孢子液涂布于SDAY上，在25℃和12:12(L:D)h条件下培养3d后，用打孔器从平板上截取直径5mm的菌片，在超声波破碎仪上将菌片上的分生孢子振动洗入2ml 0.02%吐温80中，滤去菌丝，用血球计数板计算测定孢子浓度，再换算为每cm²平板上的产孢量。每个平板打3个孔进行孢子含量测定取其平均值,作为1个重复的孢子数。各菌株重复测定3次。

表2球孢白僵菌BbQLU1的生长量测定

由表2可见，球孢白僵菌BbQLU1的菌株第四天开始出现白色分生孢子，产孢量为0.05×10⁸个/cm²。

2.3致病力的测定

取5株菌株BbQLU1、BbQLU2、BbCPS1、BbCPS2、BbCPS3进行蛴螬幼虫致病力的测定，菌株分别采自山东济南市、山东烟台市和江苏常州市，经过分离纯化获得，经鉴定均为球孢白僵菌。用含有0.1%的吐温-80的无菌水将原液配制成1×10⁸孢子/ml的孢子悬浮液，每组设3个重复区，每区30头，每只浸蘸10s，每天观察记录幼虫的死亡情况,连续观察50天。

表3不同菌株对蛴螬幼虫的致病力的测定

由表3可知，本发明的菌株BbQLU1对蛴螬幼虫的致病力最强，使蛴螬的幼虫的致病率达到95.6%，略高于其他供试菌株BbQLU2。

实施例3球孢白僵菌BbQLU1对蛴螬幼虫的防治效果

3.1孢悬液的制备

将单孢分离纯化的球孢白僵菌菌种置于SDAY培养基培养13-16天，让其长出大量的分生孢子，用灭菌的不锈钢钥匙将培养好的分生孢子刮入一个灭过菌的盛有0.1%的吐温-80无菌水的100ml的离心管中，在快速振荡器上充分震荡混匀，用规格为（25格×16格）血球计数板计数孢子悬浮液（该悬浮液即为球孢白僵菌BbQLU1菌剂）中的孢子的个数，并按照公式计算分生孢子的浓度，进而将原液按照一定的比例进行稀释配制成浓度为1×10⁸个/ml，备用。

3.2试虫接种

本次试验的致病性的测定是利用浸蘸法，根据以上配制成的1×10⁸个/ml的孢子悬浮液对1龄健康的蛴螬幼虫进行浸蘸，浸蘸时间为10s，置于无菌的滤纸上，任其爬行晾干身体上的水分，然后放入无菌的塑料饭盒中，并以碎木屑为食物。每个浓度梯度3次重复，每重复20头试虫，以0.1%的吐温-80作为对照。处理后每天观测1次，记录试虫的死亡数。死虫保湿培养观察菌丝生长及产孢情况（虫尸上长出肉眼可见的菌丝及孢子），并挑片在显微镜下观察是否为白僵菌感染致死，统计死亡率以及感染率。

白僵菌BbQLU1采用10⁸个/ml的孢子悬浮液接种蛴螬幼虫30天后，蛴螬幼虫的死亡率达到90%以上，死亡高峰期在15-25天。实验组5天后就出现死虫，经保湿培养后发现，感染率为90%以上，而对照组未出现感染的现象。统计培养期间处理组和对照组蛴螬的累计死亡数量，经DPS统计分析得到LT₅₀(半致死时间)。结果表明，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）BbQLU1菌株对一龄蛴螬幼虫的LT₅₀为22.6天，显著优于其他实验菌株的防治效果。