本发明涉及微生物培养技术领域，具体涉及一种白僵菌分离扩繁方法。
背景技术：
白僵菌是一种子囊菌类的虫生真菌，主要种类包括球孢白僵菌和布氏白僵菌等，常通过无性繁殖生成分生孢子，菌丝有横隔有分枝。白僵菌可以侵入6个目15科200多种昆虫、螨类的虫体内大量繁殖，同时产生白僵素(非核糖体多肽类毒素)、卵孢霉素(苯醌类毒素)和草酸钙结晶，这些物质可引起昆虫中毒，打乱新陈代谢以致死亡。其中，球孢白僵菌为子囊菌类的真菌，可工业化培养生产，人们利用其产生的分子孢子可加工成微生物杀虫剂。
中药白僵蚕也是基于白僵菌的以上特性产生的，昆虫家蚕的幼虫在未吐丝前，因感染白僵菌而发病致死，虫体僵化即为白僵蚕，外用其药，味咸、辛，性平，可治面上黑及碍容性疾病，白僵蚕含有氨基酸和活性丝光素，有营养皮肤和美容作用；所含蛋白质有刺激上皮脂腺，调节性激素分泌的作用，因而对女性性激素分泌失调引起的黄褐斑有一定疗效；含维生素E，能清除自由基，抗脂质氧化形成的老年斑；所含的活性丝光素能促使皮肤细胞新生，调节皮脂，改善皮肤微循环，可增白防晒，消除色素沉着，保持皮肤弹性。人工培养白僵菌，并采用白僵菌感染家蚕即能得到工业化的白僵蚕产品，因此，白僵菌的分离扩繁生产过程尤为重要。然而，现有白僵菌的分离及扩繁生产周期较长，在生产过程中易受杂菌污染，白僵菌产量不高，质量并不稳定，成本也较高。
技术实现要素：
有鉴于此，本申请提供一种白僵菌分离扩繁方法，所述方法的工艺简单，生产成本低，生产周期短，提高了生产效率，显著减少杂菌污染，成功率高，扩繁后的白僵菌质量稳定。
为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是一种白僵菌分离扩繁方法，所述方法包括以下步骤：
(1)白僵菌孢子液制备：用无菌接种环从白僵蚕表面挑取3—4环分生孢子粉，置于无菌水中，振荡10—15min，直至均匀，得白僵菌孢子液；
(2)分离纯化培养：将步骤(1)得到的白僵菌孢子液接种于选择培养基中，在25—26℃条件下培养4—6天，得白僵菌菌种，所述选择培养基的组分包括：PDA培养基，补充龙胆紫、苯菌灵、脱氧胆酸钠、头孢霉素、放线菌酮、多果定中的至少一种；
(3)一次扩大培养：将步骤(2)得到的白僵菌菌种接种于液体培养基中，在24—25℃、振荡条件下培养2—3天，得到白僵菌菌丝体，所述液体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖4—6份、马铃薯汁5—10份、蛋白胨2—10份、头孢霉素1—2份、BaCl21—2份、CaCl21—2份、无菌水20—80份；
(4)二次扩大培养：将步骤(3)得到的白僵菌菌丝体接种于固体培养基中，在25—26℃条件下培养5—9天，得到扩繁后的白僵菌，所述固体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖2—5份、豆粕3—8份、玉米粉10—20份。
优选的，步骤(2)中所述选择培养基的组分包括：PDA培养基，补充苯菌灵、脱氧胆酸钠、头孢霉素中的至少一种。
更为优选的，步骤(2)中所述选择培养基的组分按重量份数计包括：PDA培养基，补充脱氧胆酸钠2—4份、头孢霉素3—5份。
更为优选的，步骤(2)中所述选择培养基的组分按重量份数计包括：PDA培养基，补充苯菌灵1—2份、脱氧胆酸钠2—4份。
优选的，步骤(3)所述液体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖5份、马铃薯汁7份、蛋白胨8份、头孢霉素2份、BaCl21份、CaCl22份、无菌水70份。
优选的，步骤(4)所述固体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖3.5份、豆粕7份、玉米粉15份。
优选的，所述白僵菌孢子液制备步骤之前，先将白僵蚕表面用75％酒精消毒，再置于无菌培养皿中培养4—5天，直至白僵蚕表面长出菌丝和分生孢子。
优选的，步骤(2)所述选择培养基的制备方法为：取灭菌后冷却至65—68℃的PDA培养基，加入龙胆紫、苯菌灵、脱氧胆酸钠、头孢霉素、放线菌酮、多果定中的至少一种，待冷却至40—45℃时，再加入硫酸卡那霉素，待所述选择培养基凝固即可。
优选的，所述二次扩大培养的湿度控制在92—94％。
其中，本申请技术方案所述的白僵菌为球孢白僵菌。
所述的PDA培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，即Potato Dextrose Agar Medium。其做法是：称取200g洗净去皮的马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20—30min，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，再根据实验需要加1—10g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，115℃灭菌20分钟后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后即得。
本申请技术方案中提供了一种白僵菌的分离扩繁方法，采用白僵蚕虫体上的孢子粉，制得白僵菌孢子液，通过在选择培养基中培养，对白僵菌的菌种进行分离，通过在PDA培养基中，补充龙胆紫、苯菌灵、脱氧胆酸钠、头孢霉素、放线菌酮、多果定中的至少一种的组合，通过组分之间的协同作用，能够避免杂菌的生长，且能够促进白僵菌孢子的生长，得到纯净的白僵菌菌体，同时分离纯化后的白僵菌菌体经过一次扩大培养和二次扩大培养，针对于白僵菌菌体本身特性设置了液体培养基和固体培养基，其中液体培养基中含有葡萄糖、马铃薯汁、蛋白胨，为白僵菌菌丝体提供丰富的碳源、氮源，含有的BaCl2和CaCl2为菌丝生长和产孢提供钡元素和钙元素，含有的头孢霉素能够避免杂菌生成污染，且不会影响白僵菌菌丝体的生长，通过液体培养基的培养，能够提高菌丝生长期间的湿度，便于控制菌丝生长的温度，加快了白僵菌菌丝体的生长；其中固体培养基中含有葡萄糖、豆粕、玉米粉，为菌丝生长提供碳源和氮源，此外，豆粕和玉米粉具有疏松质地，具有较好的保湿性和透气性，提供湿润和透气的环境，有利于白僵菌菌丝体的快速繁殖和产孢。
通过以上技术方案对白僵菌进行分离和扩繁，工艺简单，生产成本低，生产周期短，提高了生产效率，显著减少杂菌污染，成功率高，扩繁后的白僵菌质量稳定。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
本实施例所述的一种白僵菌分离扩繁方法，包括以下步骤：
(1)白僵菌孢子液制备：将被球孢白僵菌感染后的白僵蚕表面用75％酒精消毒，再置于无菌培养皿中培养，直至白僵蚕表面长出菌丝和分生孢子，用无菌接种环从白僵蚕表面挑取3—4环分生孢子粉，置于无菌水中，振荡10—15min，直至均匀，得白僵菌孢子液；
(2)分离纯化培养：取灭菌后冷却至65—68℃的PDA培养基，按重量份数计，加入脱氧胆酸钠3份、头孢霉素4份，待冷却至40—45℃时，再加入硫酸卡那霉素1份，凝固后形成选择培养基，将步骤(1)得到的白僵菌孢子液接种于选择培养基中，在25—26℃条件下培养4天，得白僵菌菌种；
(3)一次扩大培养：将步骤(2)得到的白僵菌菌种接种于液体培养基中，在24—25℃、振荡条件下培养2天，得到白僵菌菌丝体，所述液体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖5份、马铃薯汁7份、蛋白胨8份、头孢霉素2份、BaCl21份、CaCl22份、无菌水70份；
(4)二次扩大培养：将步骤(3)得到的白僵菌菌丝体接种于固体培养基中，在25—26℃温度和93％湿度的条件下培养8天，得到扩繁后的白僵菌，所述固体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖3.5份、豆粕7份、玉米粉15份。
本实施例所述白僵菌的分离扩繁方法，其产孢量为7.1×109个/g固体培养基，孢子萌发率达96％。
实施例2
本实施例所述的一种白僵菌分离扩繁方法，包括以下步骤：
(1)白僵菌孢子液制备：将被球孢白僵菌感染后的白僵蚕表面用75％酒精消毒，再置于无菌培养皿中培养，直至白僵蚕表面长出菌丝和分生孢子，用无菌接种环从白僵蚕表面挑取3—4环分生孢子粉，置于无菌水中，振荡10—15min，直至均匀，得白僵菌孢子液；
(2)分离纯化培养：取灭菌后冷却至65—68℃的PDA培养基，按重量份数计，加入苯菌灵2份、脱氧胆酸钠3份，待冷却至40—45℃时，再加入硫酸卡那霉素1份，凝固后形成选择培养基，将步骤(1)得到的白僵菌孢子液接种于选择培养基中，在25—26℃条件下培养4天，得白僵菌菌种；
(3)一次扩大培养：将步骤(2)得到的白僵菌菌种接种于液体培养基中，在24—25℃、振荡条件下培养2天，得到白僵菌菌丝体，所述液体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖5份、马铃薯汁7份、蛋白胨8份、头孢霉素2份、BaCl21份、CaCl22份、无菌水70份；
(4)二次扩大培养：将步骤(3)得到的白僵菌菌丝体接种于固体培养基中，在25—26℃温度和93％湿度的条件下培养5天，得到扩繁后的白僵菌，所述固体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖3.5份、豆粕7份、玉米粉15份。
本实施例所述白僵菌的分离扩繁方法，其产孢量为7.1×109个/g固体培养基，孢子萌发率达96％。
实施例3
本实施例所述的一种白僵菌分离扩繁方法，包括以下步骤：
(1)白僵菌孢子液制备：将被球孢白僵菌感染后的白僵蚕表面用75％酒精消毒，再置于无菌培养皿中培养，直至白僵蚕表面长出菌丝和分生孢子，用无菌接种环从白僵蚕表面挑取3—4环分生孢子粉，置于无菌水中，振荡10—15min，直至均匀，得白僵菌孢子液；
(2)分离纯化培养：取灭菌后冷却至65—68℃的PDA培养基，按重量份数计，加入脱氧胆酸钠2份、头孢霉素3份，待冷却至40—45℃时，再加入硫酸卡那霉素1份，凝固后形成选择培养基，将步骤(1)得到的白僵菌孢子液接种于选择培养基中，在25—26℃条件下培养4天，得白僵菌菌种；
(3)一次扩大培养：将步骤(2)得到的白僵菌菌种接种于液体培养基中，在24—25℃、振荡条件下培养3天，得到白僵菌菌丝体，所述液体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖4份、马铃薯汁2份、蛋白胨2份、头孢霉素1份、BaCl21份、CaCl21份、无菌水20份；
(4)二次扩大培养：将步骤(3)得到的白僵菌菌丝体接种于固体培养基中，在25—26℃温度和92％湿度的条件下培养6天，得到扩繁后的白僵菌，所述固体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖2份、豆粕3份、玉米粉10份。
本实施例所述白僵菌的分离扩繁方法，其产孢量为6.9×109个/g固体培养基，孢子萌发率达95％。
实施例4
本实施例所述的一种白僵菌分离扩繁方法，包括以下步骤：
(1)白僵菌孢子液制备：将被球孢白僵菌感染后的白僵蚕表面用75％酒精消毒，再置于无菌培养皿中培养，直至白僵蚕表面长出菌丝和分生孢子，用无菌接种环从白僵蚕表面挑取3—4环分生孢子粉，置于无菌水中，振荡10—15min，直至均匀，得白僵菌孢子液；
(2)分离纯化培养：取灭菌后冷却至65—68℃的PDA培养基，按重量份数计，加入脱氧胆酸钠4份、头孢霉素5份，待冷却至40—45℃时，再加入硫酸卡那霉素1份，凝固后形成选择培养基，将步骤(1)得到的白僵菌孢子液接种于选择培养基中，在25—26℃条件下培养5天，得白僵菌菌种；
(3)一次扩大培养：将步骤(2)得到的白僵菌菌种接种于液体培养基中，在24—25℃、振荡条件下培养2天，得到白僵菌菌丝体，所述液体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖6份、马铃薯汁10份、蛋白胨10份、头孢霉素2份、BaCl22份、CaCl22份、无菌水80份；
(4)二次扩大培养：将步骤(3)得到的白僵菌菌丝体接种于固体培养基中，在25—26℃温度和94％湿度的条件下培养7天，得到扩繁后的白僵菌，所述固体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖5份、豆粕8份、玉米粉20份。
本实施例所述白僵菌的分离扩繁方法，其产孢量为7.2×109个/g固体培养基，孢子萌发率达96％。
实施例5
本实施例所述的一种白僵菌分离扩繁方法，包括以下步骤：
(1)白僵菌孢子液制备：将被球孢白僵菌感染后的白僵蚕表面用75％酒精消毒，再置于无菌培养皿中培养，直至白僵蚕表面长出菌丝和分生孢子，用无菌接种环从白僵蚕表面挑取3—4环分生孢子粉，置于无菌水中，振荡10—15min，直至均匀，得白僵菌孢子液；
(2)分离纯化培养：取灭菌后冷却至65—68℃的PDA培养基，按重量份数计，加入苯菌灵1份、脱氧胆酸钠2份，待冷却至40—45℃时，再加入硫酸卡那霉素1份，凝固后形成选择培养基，将步骤(1)得到的白僵菌孢子液接种于选择培养基中，在25—26℃条件下培养5天，得白僵菌菌种；
(3)一次扩大培养：将步骤(2)得到的白僵菌菌种接种于液体培养基中，在24—25℃、振荡条件下培养3天，得到白僵菌菌丝体，所述液体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖4份、马铃薯汁2份、蛋白胨2份、头孢霉素1份、BaCl21份、CaCl21份、无菌水20份；
(4)二次扩大培养：将步骤(3)得到的白僵菌菌丝体接种于固体培养基中，在25—26℃温度和92％湿度的条件下培养9天，得到扩繁后的白僵菌，所述固体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖2份、豆粕3份、玉米粉10份。
本实施例所述白僵菌的分离扩繁方法，其产孢量为7.08×109个/g固体培养基，孢子萌发率达95％。
实施例6
本实施例所述的一种白僵菌分离扩繁方法，包括以下步骤：
(1)白僵菌孢子液制备：将被球孢白僵菌感染后的白僵蚕表面用75％酒精消毒，再置于无菌培养皿中培养，直至白僵蚕表面长出菌丝和分生孢子，用无菌接种环从白僵蚕表面挑取3—4环分生孢子粉，置于无菌水中，振荡10—15min，直至均匀，得白僵菌孢子液；
(2)分离纯化培养：取灭菌后冷却至65—68℃的PDA培养基，按重量份数计，加入苯菌灵2份、脱氧胆酸钠4份，待冷却至40—45℃时，再加入硫酸卡那霉素1份，凝固后形成选择培养基，将步骤(1)得到的白僵菌孢子液接种于选择培养基中，在25—26℃条件下培养4天，得白僵菌菌种；
(3)一次扩大培养：将步骤(2)得到的白僵菌菌种接种于液体培养基中，在24—25℃、振荡条件下培养3天，得到白僵菌菌丝体，所述液体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖6份、马铃薯汁10份、蛋白胨10份、头孢霉素2份、BaCl22份、CaCl22份、无菌水80份；
(4)二次扩大培养：将步骤(3)得到的白僵菌菌丝体接种于固体培养基中，在25—26℃温度和94％湿度的条件下培养8天，得到扩繁后的白僵菌，所述固体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖5份、豆粕8份、玉米粉20份。
本实施例所述白僵菌的分离扩繁方法，其产孢量为7.1×109个/g固体培养基，孢子萌发率达95％。
实施例7
本实施例所述的一种白僵菌分离扩繁方法，包括以下步骤：
(1)白僵菌孢子液制备：将被球孢白僵菌感染后的白僵蚕表面用75％酒精消毒，再置于无菌培养皿中培养，直至白僵蚕表面长出菌丝和分生孢子，用无菌接种环从白僵蚕表面挑取3—4环分生孢子粉，置于无菌水中，振荡10—15min，直至均匀，得白僵菌孢子液；
(2)分离纯化培养：取灭菌后冷却至65—68℃的PDA培养基，按重量份数计，加入头孢霉素2份、放线菌酮3份、多果定1份，待冷却至40—45℃时，再加入硫酸卡那霉素1份，凝固后形成选择培养基，将步骤(1)得到的白僵菌孢子液接种于选择培养基中，在25—26℃条件下培养6天，得白僵菌菌种；
(3)一次扩大培养：将步骤(2)得到的白僵菌菌种接种于液体培养基中，在24—25℃、振荡条件下培养2天，得到白僵菌菌丝体，所述液体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖5份、马铃薯汁7份、蛋白胨8份、头孢霉素2份、BaCl21份、CaCl22份、无菌水70份；
(4)二次扩大培养：将步骤(3)得到的白僵菌菌丝体接种于固体培养基中，在25—26℃温度和93％湿度的条件下培养7天，得到扩繁后的白僵菌，所述固体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖3.5份、豆粕7份、玉米粉15份。
本实施例所述白僵菌的分离扩繁方法，其产孢量为7.06×109个/g固体培养基，孢子萌发率达95％。
实施例8
本实施例所述的一种白僵菌分离扩繁方法，包括以下步骤：
(1)白僵菌孢子液制备：将被球孢白僵菌感染后的白僵蚕表面用75％酒精消毒，再置于无菌培养皿中培养，直至白僵蚕表面长出菌丝和分生孢子，用无菌接种环从白僵蚕表面挑取3—4环分生孢子粉，置于无菌水中，振荡10—15min，直至均匀，得白僵菌孢子液；
(2)分离纯化培养：取灭菌后冷却至65—68℃的PDA培养基，按重量份数计，加入龙胆紫1份、苯菌灵3份、多果定1份，待冷却至40—45℃时，再加入硫酸卡那霉素1份，凝固后形成选择培养基，将步骤(1)得到的白僵菌孢子液接种于选择培养基中，在25—26℃条件下培养4天，得白僵菌菌种；
(3)一次扩大培养：将步骤(2)得到的白僵菌菌种接种于液体培养基中，在24—25℃、振荡条件下培养3天，得到白僵菌菌丝体，所述液体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖5份、马铃薯汁7份、蛋白胨8份、头孢霉素2份、BaCl21份、CaCl22份、无菌水70份；
(4)二次扩大培养：将步骤(3)得到的白僵菌菌丝体接种于固体培养基中，在25—26℃温度和93％湿度的条件下培养6天，得到扩繁后的白僵菌，所述固体培养基的组分按重量份数计包括：葡萄糖3.5份、豆粕7份、玉米粉15份。
本实施例所述白僵菌的分离扩繁方法，其产孢量为7.0×109个/g固体培养基，孢子萌发率达95％。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。