专利名称：蛴螬总生物碱的制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛴螬总生物碱有效部位的提取和制备，及其在制备抗癌药物中的应用，属于中药现代化领域。
背景技术：
挤赠为金龟子科昆虫朝鲜黑金龟子Holotrichia diomphalia Bates及同属近缘昆虫的干燥幼虫。始载于汉代《神农本草经》。历代典籍中收载的其它别名有乳齐、地蚕、 土蚕、老母虫、核桃虫等。蛴螬味咸，微温，有小毒，归肝经。在中医学中则有着悠久的应用历史，有破血，行瘀，散结，通乳的作用，可治疗折损瘀痛，痛风，破伤风，喉痹，目翳，丹毒，痈疽，痔漏等。蛴螬生活于3 6cm深的土内，喜食刚播种的种子、根、块茎以及幼苗，是世界性的地下害虫。据资源调查显示，蛴螬在我国分布很广，主产于江苏、安徽、四川、河北、山东、 河南和东北等地。从黑龙江起至长江以南地区以及内蒙古、陕西等地均有分布，资源丰富。近年来，随着人们对天然药物的研究越来越深入，蛴螬也受到了研究人员的关注。曹蔚等(曹蔚，刘丹，王四旺，等.不同产地蛴螬中蛋白质、氨基酸和无机元素分析.中药材，2010，10(10) =1538-1541)对全国不同产地蛴螬的蛋白质、氨基酸和无机元素等含量进行测定。结果表明不同产地蛴螬中含有的成分有一定差异，蛋白质含量为33. 4 44. 4%，江西产蛋白质含量最高；各产地蛴螬中均含有17种氨基酸，其中7种为人体必需，含量较高的有谷氨酸(5. 21% 7.03% )、酪氨酸(4. 10% 5. 27% )、天门冬氨酸 (3. 21% 5. 35% )。《中国药用昆虫集成》中记载蛴螬含有脂肪、外细胞糖酶，蔗糖酶等多种酶。此外国外文献报道挤赠含有两种酹氧化酶原(Propo-Ι和Propo-II),三种酹氧化酶原活化因子(PPAF-I、PPAF-II和PPAF-III)及数种活性多肽，如脂多糖识别蛋白、抗菌肽 holotricinl III(Kim MS,Baek MH,Lee MH,et al.A new easter-type serine protease cleaves a masquerade-1 ike protein during prophenoloxidase activation in Holotirichia diomphalia larvae. Journal of Biological Chemistry，2002，277(42) 39999-40004)。韩国学者 Piao 等(Piao SF, Kim DK, Park JW, et al. Overexpression and preliminary X-ray crystallographic analysis of prophenoioxidase activating factor II，a clip domain family of serine proteases. Biochimica et Biophysica Acta, 2005,1752 (I) :103-106)还从蛴螬中分离得到了酚氧化酶原活化因子PPAF-II的高纯度单晶。张庆镐等(张庆镐，朴奎善，李基俊，等.蛴螬矿物元素和维生素含量分析.微量元素与健康研究，2002，19 (I) 30-31)研究发现蛴螬中Cu、Mn含量非常丰富，Ca、Mg、CiNFe、 Zn含量其次，K/Na的比值也很高；B族维生素的含量较高，维生素A和维生素E的含量也较丰富。金莉莉等从蛴螬石油醚提取物中得到的五个单体化合物，分别鉴定为棕榈酸，癸酸， 十八烷烯酸，P胆留醇，十六碳烯酸；乙酸乙酯提取物中得到了一个单体化合物鉴定为肉豆蘧酸。Dong 等(Dong Q F，Wang J L，Zhang S F，et al. The fat-soluble constituents of Holotrichia diomphalia larvae. Chemistry of Natural Compounds，2009，45 (4) 530-531)用GC-MS对蛴螬提取物的脂溶性成分分析发现其中含烯脂酸59. 94%，烷烃酸33. 46%，此外还含有反油酸、十六烷酸、十五酸和硬脂酸。药理研究发现蛴螬水浸液I : 10000浓度对兔冠状血管、离体兔耳血管、蟾蜍肺血管皆有收缩作用；I 1000浓度能兴奋离体心脏，浓度更高则导致舒张期停止；I 1000 以上能兴奋离体兔子宫，收缩蟾蜍内脏血管；I 100能抑制离体兔肠管。大剂量有利尿作用，对血压无影响。蛴螬提取物可以抑制实验性家兔脉络膜新生血管(CNV)中血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达，从而可以抑制实验性CNV的形成(陈梅，邱晓星，彭清华，等.蛴螬提取物对兔脉络膜新生血管VEGF和bFGF表达的影响.国际眼科杂志，2008,8(12) :2443-2448)。近年研究表明，蛴螬提取液具有一定的抗肿瘤活性。崔春爱等(崔春爱，孙抒，杨万山.蛴螬提取物对人肺癌A549细胞诱导凋亡作用的形态学观察.山东医药，2008，48 (27) :7_8)发现蛴螬石油醚提取物使人肺癌A549细胞核中CyclinDl的表达明显降低，进而抑制细胞的增殖和凋亡。宋莲莲等(宋莲莲，孙抒， 李香丹，等.蛴螬石油醚提取物对人宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响.中草药，2006， 37(6) =488-492)发现蛴螬石油醚提取物对HeLa细胞具有抑制增殖及诱导凋亡作用。金哲等(金哲，孙抒，李基俊，等.蛴螬提取物体外对人MGC-803胃癌细胞株凋亡相关基因作用的研究.中国中医药科技，2004,11(2) :90-92)研究发现蛴螬乙酸乙酯提取物在体外对人胃癌MGC-803细胞株有抗增殖及诱导凋亡作用，其诱导肿瘤细胞凋亡的可能机制与调节凋亡相关基因bcl-2、bax的表达改变有关。蛴螬体内含有多种抗菌肽(Lee SY, Moon HJ, Kurata S，et al. Purification and eDNA cloning of an antifungal protein from the hemolymph of Holotrichia diomphaiia larvae. Biological pharmaceutical bulletin， 1995,18(8) :1049-1052.) o其中holotricin I对革兰氏阳性菌有很强的抗菌活性，但对革兰氏阴性菌的抗菌活性不明显；holotricin II能抑制革兰阴性菌的生长。此外，近期研究发现蛴螬的乙醇和石油醚提取物具有较强的抗真菌活性(Dong QF, Wang JL, Zhang SF, et al. Antifungal activity of crude extracts and fat-soluble constituents of Holotrichia diomphalia larvae. Bioresource Technology，2008，99 (17) :8521-8523)。 蛴螬单味药作用于由氯仿和β-D-氨基半乳糖诱导的急性肝细胞损伤，可降低小鼠血浆中转氨酶的含量。肝硬化模型小鼠经4周蛴螬治疗后，血浆中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶以及碱性磷酸酶的活性同时降低；肝脏中羟脯氨酸的含量降低，保肝作用强于水飞蓟素(Oh WYiPyo S,Lee KR,et al. Effect of Holotrichia diomphalia larvae on liver fibrosis and hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology，2003，87(2-3) :175-180)。尽管如此，蛴螬化学成分方面的研究较少，更鲜有蛴螬生物碱的报道。我们对蛴螬生物碱的提取分离工艺进行了探索，对蛴螬生物碱的药理作用进行了进一步研究。首次发现蛴螬生物碱具有抗肿瘤的药理作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛴螬总生物碱及其制备方法。本发明的另一个目的是提供该蛴螬总生物碱在制备具有抗癌活性药物的用途。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种蛴螬总生物碱的制备方法，包括以下步骤(I)乙醇提取将蛴螬粉碎成粗粉，用50 95%乙醇浸泡12 24h，加热回流、浸溃或渗漉提取；(2)浓缩酸化把提取液浓缩至每毫升含原药材量O. 5 5g，用O. 5 10%酸水调PH为I 2 ;(3)萃取除杂酸化液加入低极性有机溶剂萃取，静置分层后，收集水层；(4)碱化萃取水层加碱液调PH为10 12,碱化液加低极性有机溶剂萃取,静置分层后，收集有机层；(5)浓缩干燥减压浓缩有机溶剂萃取液，干燥，即得蛴螬总生物碱。上述(I)步骤中采用50 95%乙醇浸泡12 24h，最好采用70-90 %乙醇；提取方法包括加热回流、浸溃或渗漉提取等，最好为加热回流或渗漉提取。提取液浓度小于50% 可使提取液中水溶性杂质含量增高；浸溃法提取率较低。上述⑵步骤中调节PH的酸可以是无机酸如盐酸、硫酸，也可以是有机酸如柠
檬酸等。上述(3)步骤中所述低极性有机溶剂可以是卤代烷烃、苯、甲苯、二甲苯、乙醚、乙酸乙酯等低极性有机溶剂中的一种。上述(4)步骤中调节PH的碱可以是氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、氨水中的一种或两种的混合溶液，优选为NaOH或KOH ;萃取用低极性有机溶剂可以是卤代烷烃、 苯、甲苯、二甲苯、乙醚、乙酸乙酯等低极性有机溶剂中的一种。优选为氯仿或二氯甲烷。上述(5)步骤中减压浓缩物的干燥方法为真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥等。一种蛴螬总生物碱，该生物碱采用上述方法制备得到。按上述方法制备的蛴螬总生物碱为黄色，无定型粉末，微溶于水，与碘化汞钾试剂在酸性溶液中生成白色沉淀；与碘化铋钾试剂在酸性溶液中生成桔红色沉淀。一种蛴螬总生物碱的应用，将上述的蛴螬总生物碱用于制备治疗癌症的药物组合物，其中含有治疗有效量的上述蛴螬总生物碱和药学上可接受的载体。本发明得到的蛴螬总生物碱有很好的抗癌作用，可用于食管癌，肺癌，胃癌，肝癌， 结、直肠癌，神经胶质瘤，宫颈癌，白血病，黑色素瘤等的治疗。
具体实施例方式下面列举典型实施例，对本发明进一步说明，但不以任何形式构成对本发明的限制。实施例I称取蛴螬lkg，粉碎为粗粉；用2000ml 70 %乙醇润湿；装入渗漉桶中，浸溃放置 24h，使溶剂充分渗透扩散；用8000ml，70%乙醇进行渗漉，收集渗漉液；把渗漉液浓缩成 1000ml,(每毫升含原药材量Ig)，向浓缩液中加入3% H2SO4，调节PH ^ 1，每次2倍体积乙酸乙酯萃取，共萃取3次，除脂溶性杂质。取水层，加入5% NaOH调节PH ^ 12，静置8h。每次3倍体积氯仿萃取，共萃取5次，得氯仿萃取物，浓缩氯仿萃取液，干燥后，得蛴螬总生物碱 2. 95g。实施例2称取蛴螬5kg，粉碎为粗粉；用5000ml 80%乙醇润湿；浸溃放置24h ;用20000ml， 80%乙醇进行渗漉，收集渗漉液；把渗漉液浓缩成1250ml (每毫升含原药材量4g)，向浓缩液中加入2% HC1，调节PH 2，每次I倍体积乙酸乙酯萃取，共萃取2次，除脂溶性杂质。 取水层，加入3% NaOH调节PH ^ 11，静置12h。每次2倍体积氯仿萃取，共萃取6次，得氯仿萃取物，浓缩氯仿萃取液，干燥后，得蛴螬总生物碱8. 03g。实施例3称取蛴螬500g，粉碎为粗粉；置于索氏提取器中用IOOOml 95%乙醇润湿；浸溃 12h ;共用2000ml95%乙醇回流提取，收集提取液；把提取液浓缩成200ml (每毫升含原药材量2. 5g)，向浓缩液中加入2% HCl，调节PH 2，每次3倍体积二氯乙烷萃取，共萃取2次， 除脂溶性杂质。取水层，加入氨水调节PH 10，静置8h。每次2倍体积二氯乙烷萃取，共萃取6次，得氯仿萃取物，浓缩氯仿萃取液，干燥后，得蛴螬总生物碱O. 50g。实施例4称取蛴螬2kg，粉碎为粗粉；用2000ml 60%乙醇润湿；浸溃放置24h ;用8000ml， 80%乙醇回流提取2小时，滤出乙醇提取液，把浸过的药渣按上述方法再处理两次，合并三次滤出的乙醇提取液，减压浓缩成2500ml (每毫升含原药材量O. 8g)，用4 % HCl酸化，调节PH 1，每次3倍体积乙醚萃取，共萃取2次，除脂溶性杂质。取水层，加入4% KOH调节 PH 11，静置8h。每次3倍体积氯仿萃取，共萃取4次，得氯仿萃取物，浓缩氯仿萃取液，干燥后，得蛴螬总生物碱2. 67g。实施例5称取蛴螬1kg，粉碎为粗粉；用8000ml 80%乙醇在室温浸溃24小时，滤出乙醇提取液，把浸过的药渣按上述方法再处理三次，合并四次滤出的乙醇提取液，减压浓缩成 500ml (每毫升含原药材量2g)，用2% H2SO4酸化，调节PH ^ 2，每次2倍体积乙酸乙酯萃取，共萃取3次。取水层，加入5% NaOH调节PH 12静置8h。每次2倍体积氯仿萃取，共萃取8次，得氯仿萃取物，浓缩氯仿萃取液，干燥后，得蛴螬总生物碱3. 15g。以下通过试验例来进一步阐明本发明所述蛴螬总生物碱对癌症的治疗效果。试验例I :蛴螬总生物碱对体外培养的食管癌，肺癌，胃癌，肝癌，结肠癌，神经胶质瘤，宫颈癌，白血病，黑色素瘤的生长抑制作用实验试剂环磷酰胺购于恒瑞医药股份有限公司。噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜 (DMSO)为Sigma产品；RPMI 1640、DMEM、胰蛋白酶及小牛血清为Gibco产品。其余试剂均为国产分析纯。细胞培养使用RPMI 1640或DMEM培养液(含10%灭活的小牛血清、100U -πιΓ1 青霉素和IOOmg · Γ1链霉素)，置于37°C、5% CO2孵箱中培养。对体外培养的肿瘤细胞的抑制作用取对数生长期的细胞，以3 5X 107/1的密度接种于96孔板，每孔100μ 1，在37°C C,5% CO2饱和湿度条件下培养12h。试验设阴性对照组、DMSO溶剂对照组、不同浓度给药组。每个培养孔加入O. 2 20 μ g/ml的蛴螬生物碱(用DMSO溶解，终浓度彡O. 5% ) 100 μ 1，使终浓度为O. I 10 μ g/ml，每个浓度设6个复孔，37°C>5% CO2饱和湿度孵箱内培养24h，每孔加入MTT液(5g/l) 20 μ L，培养4h后，离心，吸弃培养液，每孔加入150 μ L 二甲基亚砜，轻度振荡溶解结晶，置自动酶标仪570nm波长处测OD值，按下列公式计算细胞生长的抑制率细胞生长抑制率/% = (I-给药组OD值 /对照组OD值)X 100 %，实验重复3次。结果MTT法测定蛴螬总生物碱对人神经胶质瘤U251、结肠癌SWl 116、肝癌!fepG2、 肺癌A549、宫颈癌HeLa、胃癌SGC7901、黑色素瘤A375、白血病HL-60、食管癌Eca-109细胞的生长抑制作用，结果表明蛴螬生物碱在O. I 10 μ g/ml浓度范围内能明显抑制U251、 SW1116、!fepG2、A549、HeLa、SGC7901、A375、HL-60、Eca-109 细胞的增殖，抑制作用具有浓度依赖性，结果见表1、2。 表I蛴螬生物碱对肿瘤细胞增殖的抑制作用I (7±^ η= 6)
权利要求
1.蛴螬总生物碱的制备方法，其特征在于该生物碱是由下述制备方法制成的(1)乙醇提取将蛴螬粉碎成粗粉，用50 95%乙醇浸泡12 24h，加热回流、浸溃或渗漉提取；(2)浓缩酸化把提取液浓缩至每毫升含原药材量O.5 5g，用O. 5 10%酸水调PH 为I 2 ;(3)萃取除杂酸化液加入低极性有机溶剂萃取，静置分层后，收集水层；(4)碱化萃取水层加碱液调PH为10 12,碱化液加低极性有机溶剂萃取,静置分层后，收集有机层；(5)浓缩干燥减压浓缩有机溶剂萃取液，干燥，即得蛴螬总生物碱。
2.根据权利要求I所述的蛴螬总生物碱的制备方法，其特征在于所述(I)步骤中采用 70 90%乙醇，用加热回流或渗漉的方法提取。
3.根据权利要求I所述的蛴螬总生物碱的制备方法，其特征在于所述(2)步骤中调节 PH的酸可以是无机酸如盐酸、硫酸，也可以是有机酸如柠檬酸。
4.根据权利要求I所述的蛴螬总生物碱的制备方法，其特征在于，所述低极性有机溶剂可以是卤代烷烃、苯、甲苯、二甲苯、乙醚、乙酸乙酯等低极性有机溶剂中的一种。
5.根据权利要求I所述的蛴螬总生物碱的制备方法，其特征在于总生物碱提取和精制提纯过程调节PH的碱可以是氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、氨水中的一种或两种的混合溶液。
6.根据权利要求6所述的蛴螬总生物碱的制备方法，其特征在于，调PH的碱优选为 NaOH 或 KOH。
7.—种蛴螬总生物碱，其特征是经权利要求I至6之一的蛴螬总生物碱的制备方法所制备。
8.用于治疗癌症的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求7所述的蛴螬总生物碱和药学上可接受的载体。
9.权利要求8的蛴螬总生物碱药物组合物在制备抗癌药物中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，所述癌症包括食管癌,肺癌，胃癌,肝癌，结、直肠癌，神经胶质瘤，宫颈癌，白血病，黑色素瘤。
全文摘要
本发明公开了一种蛴螬总生物碱的制备方法，和以该化合物为活性成分的药物组合物，该药物组合物在制备治疗抗癌药物中的应用。蛴螬总生物碱的制备方法包括乙醇提取、浓缩酸化、萃取除杂、碱化萃取和减压浓缩等工艺步骤。蛴螬总生物碱及其组合物可用于癌症，包括食管癌，胃癌，乳腺癌、肝癌，肺癌，结、直肠癌、神经胶质瘤、白血病等的治疗。
文档编号A61P35/00GK102579506SQ20121010196
公开日2012年7月18日 申请日期2012年4月9日 优先权日2012年4月9日
发明者张雅, 曹蔚, 杨倩, 王四旺, 谢艳华 申请人:中国人民解放军第四军医大学