一种从山胡桃根中提取生物碱的制备方法及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然植物提取分离技术领域，具体涉及一种从山胡桃根中提取生物碱 的制备方法及其用途。
【背景技术】
[0002] 樟科Lauraceae山胡椒属Lindera Thunb.植物全世界约有100种，分布于亚洲、北 美温热带地区。我国有40种9变种2变型。山胡椒属是我国樟科中种类较多，分布较广的属之 一。山胡椒Lindera glauca (Siebold & Zucc·) Blume，生于海拔900米左右以下山坡、林 缘、路旁。在我国的山东昆嵛山以南、河南嵩县以南，陕西郧县以南以及甘肃、山西、江苏、安 徽、浙江、江西、福建、台湾、广东、广西、湖北、湖南、四川等省区分布较广。木材可作家具； 叶、果皮可提芳香油;种仁油含月桂酸，油可作肥皂和润滑油;根、枝、叶、果药用；叶可温中 散寒、破气化滞、祛风消肿;根治劳伤脱力、水湿浮肿、四肢酸麻、风湿性关节炎、跌打损伤； 果实治胃痛。
[0003] 针对山胡椒生物碱类成分分离鉴定工作较多，但是针对该植物中分离得到的生物 碱抗肿瘤活性研究较少，仅见对山胡椒抗肿瘤转移化学成分进行了报道，但对其活性成分 的深入研究，特别是对不同肿瘤细胞株增殖的抑制活性研究，尚未见有报道。
[0004] 因此，选择适宜的提取方法制备山胡椒总生物碱，并对总生物碱中的单体化合物 进行分离纯化研究，寻找具有抗肿瘤活性的单体化合物，对合理开发利用山胡椒资源具有 有重要意义。但是，现有的针对山胡椒总生物碱提取纯化技术工艺主要存在以下不足之处： (1)使用高浓度醇溶液作为提取介质，成本较高，提取不够完全;而采用水作提取介质，虽然 经济，但提取有效成分的效率低，山胡椒根中生物碱类有效成分难以有效浸出。（2)传统提 取方法如煎煮、回流、浸渍等，提取过程涉及到加热处理或者耗时太长，并且提取液过滤处 理步骤多，收率也不理想。结合以上两点，本发明采用酸性醇水溶液作为提取溶剂，反复回 收利用提取，能显著提高提取效率。并采用渗漉提取，浸出液可以达到较高浓度，浸出效果 较好。此法常温操作不需加热，溶剂用量少，过滤要求较低，使分离操作过程简化。且提取物 含杂质少、提取率高、使用溶剂量少，同时节约溶剂，降低成本。
[0005] 本发明为得到纯度、收率较高的生物碱总提物。在有机溶剂的选择方面不断优化 有机溶剂的用量和配比。并且，本发明采用有机溶剂萃取作为初步纯化手段，具有操作方 便、易于放大和成本低廉等优点。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术中存在的问题，本发明目的在于在提供一种从山胡桃根中提取生物 碱的制备方法及其用途。
[0007] 本发明通过以下技术方案加以实现： 所述的一种从山胡椒根中提取生物碱的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 原料处理:取山胡椒根阴干至含水量为3-8%后，粉碎，过20-80目筛，得粗粉，备用； 2) 酸性醇水溶液溶液渗漉提取:取步骤1)制得的粗粉，装入渗漉筒中，加1-2倍量的PH 值1-2的酸性醇水溶液，其中醇的浓度为30%-80%，浸润3-6小时后装入渗漉桶中，用10-18 倍量上述酸性醇水溶液溶液进行渗漉提取，调节流速，以10_20mL/min流速收集渗漉提取液 至山胡椒根粗粉中的生物碱浸提干净为止;采用薄层层析法，在254nm下显棕黑色斑点，碘 化铋钾溶液显橘黄色，所得提取液中加入碱水调节PH值至9-10,然后加入有机溶剂萃取2-6 次，制得萃取液;所述提取液与有机溶剂的体积比为1:1-3;其中色谱条件为用GF254荧光硅 胶为载体，制备薄层色谱板，以氯仿：甲醇=6:1为展开剂，在254nm紫外光灯下显色观察； 3) 将步骤2)制得的萃取液，于水浴温度40-55°C，真空度为0.09-0.1 Mpa的条件下进行 减压浓缩，浓缩至浓缩液的浓度为0.5-1. Og/ml，制得山胡椒根总生物碱提取物浓缩液； 4) 将步骤3)制得的山胡椒根总生物碱提取物浓缩液过硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇体积 比10 :1-0:1梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层色谱检测，合并相同组分，得A-E共5个组 分，进行抗肿瘤活性追踪，B、C组分抗肿瘤活性较好； 5) 对B组分，经反相柱色谱，用20-100%的甲醇-水梯度洗脱，洗脱液经薄层色谱检测，合 并相同组分，回收洗脱液得B1-B4共4个组分； 6) 将步骤5)制得的B2组分过硅胶柱，用氯仿-甲醇进行纯化，得棕黄色化合物1和化合 物2; 7) 将步骤4)制得的C组分，经反相柱色谱，用30-100%的甲醇-水梯度洗脱，洗脱液经薄 层色谱检测，合并相同组分，回收溶剂得C1-C8共8个组分； 8) 将步骤7)制得的C4组分过凝胶柱，用30-100%的甲醇-水纯化，得棕黄色化合物3; 所述化合物1为N-甲基樟苍碱，其结构式为：
所述化合物2为樟苍碱，其结构式为：
所述化合物3为(+)_Boldine，其结构式为：
[0008] 所述的一种从山胡椒根中提取生物碱的制备方法，其特征在于步骤2)中酸性醇水 溶液为浓度为〇. 5-2%的醋酸、盐酸、硫酸或酒石酸中的任一种。
[0009] 所述的一种从山胡椒根中提取生物碱的制备方法，其特征在于步骤2)中碱水为饱 和的碳酸钠溶液或15-25%的氨水。
[0010] 所述的一种从山胡椒根中提取生物碱的制备方法，其特征在于步骤2)中有机溶剂 为乙酸乙酯、乙醚、丙酮、正丁醇、氯仿或二氯甲烷中的一种或几种混合。
[0011] 所述的一种从山胡桃根中提取生物碱的制备方法，其特征在于步骤4)中氯仿-甲 醇的体积比依次为10: 1、8:1、6:1、4:1、2:1、0:1进行梯度洗脱。
[0012] 所述的一种从山胡桃根中提取生物碱的制备方法，其特征在于步骤5)中依次用 20%的甲醇-水、40%的甲醇-水、60%的甲醇-水、80%的甲醇-水、100%的甲醇依次梯度洗脱。
[0013] 所述的一种从山胡桃根中提取生物碱的制备方法，其特征在于步骤6)中氯仿-甲 醇的体积比为8:1。
[0014] 所述的一种从山胡桃根中提取生物碱的制备方法，其特征在于步骤7)中先用30% 的甲醇-水洗脱，然后依次用50%的甲醇-水、70%的甲醇-水洗脱，最后用100%甲醇洗脱;步骤 8)中现有30%的甲醇-水纯化，然后用50%的甲醇-水、70%的甲醇-水纯化，最后用100%甲醇-水纯化。
[0015] 所述的一种从山胡桃根中提取的生物碱在制备抗肿瘤药物制剂中的应用。 本发明采用低浓度醇-酸性醇水溶液作为提取溶剂，反复回收利用提取，能显著提高提 取效率。并采用渗漉提取，浸出液可以达到较高浓度，浸出效果较好。此法常温操作不需加 热，溶剂用量少，过滤要求较低，使分离操作过程简化。且提取物含杂质少、提取率高、使用 溶剂量少。
[0016] 本发明采用有机溶剂萃取作为总生物碱初步纯化手段具有萃取方便、简单、低成 本、易放大等优点。对提取的山胡椒根总生物碱，采用活性导向分离，鉴定了山胡椒根中具 有抑制肿瘤细胞增殖活性的三个生物碱类成分，尤其是化合物1具有极强的抑制多种肿瘤 细胞增殖活性，特别是抑制结肠癌细胞HT-29，胃癌细胞SGC-7901细胞增殖活性，在高剂量 给药情况下，甚至优于阳性对照药物依托泊甙VP-16。该发明采用常规的生物碱提取分离方 法，抗肿瘤活性评价方法，技术方案操作简单，容易推广。对于抗肿瘤先导化合物的发现，抗 肿瘤新药的开发具有重要的意义。
【具体实施方式】
[0017] 通过以下具体实施例对本发明作进一步详述。
[0018] 实施例1 1)原料处理:取山胡椒根600g阴干至含水量为3-8%后，粉碎，过20-80目筛，得粗粉，备 用;2)酸性醇水溶液溶液渗漉提取:取步骤1)制得的干燥粗粉，加1.5倍量的PH值1-2的酸性 醇水溶液，其中醇的浓度为50%，浸润3-6小时后装入渗漉桶中，用15倍量上述酸性醇水溶 液溶液进行渗漉提取，调节流速，以10_20mL/min流速收集渗漉提取液至山胡椒根粗粉中的 生物碱浸提干净为止;采用薄层层析法，在254nm下显棕黑色斑点，碘化铋钾溶液显橘黄色， 所得提取液中加入碱水调节PH值至9-10，然后加入有机溶剂萃取2-6次，制得萃取液;其中， 提取液与有机溶剂的体积比为1: 2;其中色谱条件为用GF254荧光硅胶为载体，制备薄层色 谱板，以氯仿：甲醇=6:1为展开剂，在254nm紫外光灯下显色观察;酸性醇水溶液为浓度为1% 的醋酸，碱水为饱和的碳酸钠溶液，机溶剂为乙酸乙酯;3)将步骤2)制得的萃取液，于水浴 温度48°C，真空度为0.09-0.1 Mpa的条件下进行减压浓缩，浓缩至浓缩液的浓度为0.8g/ml， 制得山胡椒根总生物碱提取物浓缩液;4)将山胡椒根总生物碱提取物浓缩液过硅胶柱色 谱，用氯仿-甲醇体积