一种环金属化β‑咔啉类钌配合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种环金属化β-咔啉类钌配合物及其制备方法和应用。

背景技术：

铂类药物作为金属类抗肿瘤药物的代表取得了令人瞩目的成就，但由于铂类药物的毒副作用严重限制了它们的实际疗效和适用范围，寻找高效低毒的新型金属抗癌药物，以改良或补充现有铂类药物的性能是当前的研究热点。

近年来钌配合物作为新的抗肿瘤药物引起科研人员的广泛的关注，国际上普遍认为钌及钌配合物属于低毒性，容易吸收并在体内很快排泄，是非铂类抗肿瘤药物中最有前途的药物之一。为此欧盟于1997年成立了钌类抗肿瘤药物研究和发展工作组(COST D8)，专门加强该类药物的研究。目前已经有三个金属钌配合物进入临床研究，分别是：[ImH][trans-RuCl4(Im)(DMSO)](NAMI-A)、[ImH][trans-RuCl4(Im)2](ICR)和KP1019。最新的研究表明钌配合物可以通过多种途径诱使肿瘤死亡：NAMI-A对转移瘤细胞增殖的抑制作用可能是由于能导致细胞膜的形态改变、下调CD44基因编码的表达。KP1019能抑制一些对顺铂具有耐药性的肿瘤生长，且能够连续几周重复高剂量给药而不产生毒副作用，能有选择性的作用于肿瘤细胞。另外钌配合物诱导发生细胞周期阻滞，不同钌配合物作用于不同细胞，细胞周期被阻滞的阶段可能各不相同，但最终都可阻滞细胞增殖，达到诱导细胞凋亡的目的。许多研究也表明，钌配合物可以和细胞内的各种蛋白酶类产生相互作用，达到诱导肿瘤细胞凋亡的目的，如：端粒酶，蛋白激酶、DNA拓扑异构酶、RNA聚合酶等。随着对钌配合物抑制肿瘤细胞增值作用机制研究的深入，越来越多各种类型的钌配合物被报道，为配合机制性研究，对各种易跨膜、高靶向、低毒性的结构修饰也成为一个非常重要的研究内容。

环金属化钌配合物(Cyclo-Ru)应用于抗肿瘤研究起步较晚，近年来，相关的研究报道逐渐增多。Pfeffer课题组于2007年合成了19个Cyclo-Ru，通过活性筛选发现以phpy(2-phenylpyridine)作为C-N环金属化配体的RDC11具有较好的抗肿瘤活性。随后该课题组又设计合成了一系列双齿C-N型，三齿N–C–N和N–N–C型的Cyclo-Ru。体外活性测试表明这一系列Cyclo-Ru均具有非常理想的抗肿瘤活性，其中的一部分IC₅₀值达到纳摩尔级别。中山大学巢晖教授课题组设计合成了一系列结构相似的多吡啶类Cyclo-Ru，与对应的多吡啶钌配合物比较，前者脂溶性增加，靶向细胞核，抗肿瘤活性显著提高。如：[Ru(bpy)(phpy)(dppz)]⁺与[Ru(bpy)(bpy)(dppz)]²⁺相比较，当把其中的一个Ru-N键转化为Ru-C键后，抗肿瘤活性增大100多倍，IC50值比顺铂小一个数量级，详细的抗肿瘤机制研究表明前者能够快速的聚集于细胞核，2h后达90％。与RDC11类配合物显著不同的是：多吡啶类Cyclo-Ru具有较强的DNA键合能力，能够干扰转录因子NF-κB与DNA的结合，从而抑制基因转录，诱使不可逆的细胞凋亡。

β-咔啉能够通过多种途径抑制肿瘤，如：嵌入DNA、抑制DNA拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ，抑制细胞周期激酶等。谭彩萍等研究表明β-咔啉与钌配位可以增强该生物碱的抗肿瘤活性，且可以靶向线粒体，引起自噬。对于把β-咔啉及环金属化的概念相结合，设计制备出钌类配合物，将是一个高靶向性的配合物设计策略。

技术实现要素：

本发明所要解决的首要问题是，提供一种结构新型的环金属化β-咔啉类钌配合物，所述的钌配合物具有非常优异的抗肿瘤活性。

本发明所要解决的另一个技术问题是，提供一种结构新型的环金属化β-咔啉类钌配合物的制备方法。

本发明所要解决的再一个技术问题是，提供一种结构新型的环金属化β-咔啉类钌配合物的应用。

本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：

一种环金属化β-咔啉类钌配合物，以1-phenyl-9H-pyrido[3,4-b]indole(本专利中简称为1-Ph-βC)为主配体，以2,2-联吡啶(本专利中简称为bpy)或4,4-二甲基-2,2联吡啶(本专利中简称为dmb)为辅助配体。

优选地，所述钌配合物中的阳离子具有式Ⅰ或式Ⅱ所示的结构：

优选地，所述配合物中的阴离子为无机盐离子。

最优选地，所述的无机盐离子为(PF₆)^－。

优选地，所述配合物的化学式为[Ru(bpy)₂(1-Ph-βC)](PF₆)或[Ru(dmb)₂(1-Ph-βC)](PF₆)。

上述环金属化β-咔啉类钌配合物的制备方法，包含如下步骤：

S1.色胺盐酸盐的合成：将色氨与氯化亚砜反应，即得色胺盐酸盐；

S2.1-phenyl-2,3,4,9-tetrahydro-1H-pyrido[3,4-b]indole(本专利中简称为1-Ph-4H-βC)的合成：将色胺盐酸盐与苯甲醛进行加热回流反应，反应结束将产物再加入碳酸钾溶液中进行回流反应，得1-Ph-4H-βC；

S3.1-phenyl-2-tosyl-2,3,4,9-tetrahydro-1H-pyrido[3,4-b]indole(本专利中简称为1-Ph-N-Ts-4H-βC)的合成：将1-Ph-4H-βC与三乙胺混合，然后滴加对甲苯磺酰氯，然后进行室温反应得1-Ph-N-Ts-4H-βC；

S4.1-Ph-βC的合成：将1-Ph-N-Ts-4H-βC溶于NaOH溶液中进行加热回流反应，得1-Ph-βC；

S5.环金属化β-咔啉类钌配合物的合成：将1-Ph-βC与cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O或cis-[Ru(dmb)₂Cl₂]·2H₂O进行反应，得所述的环金属化β-咔啉类钌配合物。

优选地，步骤S1中色胺盐酸盐的具体合成方法为：将色氨溶于有机溶剂中，冰浴下滴加氯化亚砜，室温反应20～40min，过滤、漂洗，即得色胺盐酸盐。最优选地，所述的有机溶剂为甲醇。

优选地，步骤S2中1-Ph-4H-βC的具体合成方法为：将色胺盐酸盐与苯甲醛以1～2:1～2的摩尔比于有机溶剂中加热回流，待反应结束后，冷却至室温，旋干；加入碳酸钾溶液充分搅拌回流，萃取、干燥得1-Ph-4H-βC；最优选地，所述的有机溶剂为乙腈。

优选地，步骤S3中1-Ph-N-Ts-4H-βC的具体合成方法为：将1-Ph-4H-βC与三乙胺按摩尔比1～2:2～4加入到有机溶剂中，-10℃下滴加与1-Ph-4H-βC等摩尔量的对甲苯磺酰氯，滴加完毕后，室温搅拌2～4h，旋干、萃取、干燥得1-Ph-N-Ts-4H-βC；优选地，所述的有机溶剂为二氯甲烷。

优选地，步骤S4中1-Ph-βC的具体合成方法为：将1-Ph-N-Ts-4H-bc溶于含有质量百分比为20％～40NaOH的DMSO溶液中，加热回流，反应完全后冷却至室温，加水搅拌，过滤、干燥得1-Ph-βC。

优选地，步骤S5中环金属化β-咔啉类钌配合物的具体合成方法为：将cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O或cis-[Ru(dmb)₂Cl₂]·2H₂O与1-Ph-βC以1～2:1～2的摩尔比在惰性气体保护下，加热回流5～8h，然后抽滤，旋干，将粗产物用200-300目中性氧化铝柱进行分离，收集中间红色带洗脱液，得所述的环金属化β-咔啉类钌配合物。

优选地，步骤S5中所述的cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O是以RuCl₃·nH₂O和bpy为原料，以氯化锂为催化剂，经加热回流制备得到。

最优选地，步骤S5中所述的cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O具体通过如下方法制备得到：将RuCl₃·nH₂O、bpy以摩尔比1～2:2～4加入到DMF中，并以氯化锂为催化剂，在惰性气体保护下加热回流，冷却至室温，然后加入丙酮，过滤、干燥即得cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O；

优选地，步骤S5中所述的cis-[Ru(dmb)₂Cl₂]·2H₂O是以RuCl₃·nH₂O和dmb为原料，以氯化锂为催化剂，经加热回流制备得到。

最优选地，步骤S5中所述的cis-[Ru(dmb)₂Cl₂]·2H₂O具体通过如下方法制备得到：将RuCl₃·nH₂O、dmb以摩尔比1～2:2～4加入到DMF中，并以氯化锂为催化剂，在惰性气体保护下加热回流，冷却至室温，然后加入丙酮，过滤、干燥即得cis-[Ru(bpy)₂Cl₂]·2H₂O。

所述的室温是指15～30℃。

上述环金属化β-咔啉类钌配合物作为抗肿瘤药物的应用。

优选地，所述的肿瘤为肝癌、乳腺癌、肺癌及宫颈癌。

上述环金属化β-咔啉类钌配合物作为细胞周期阻滞剂的应用。

优选地，所述的细胞周期阻滞剂为G0/G1期周期阻滞剂。

有益效果：本发明提供了一种全新结构的环金属化β-咔啉类钌配合物，该钌配合物具有非常优异的抗肿瘤作用；实施例中数据显示，其体外抗肿瘤活性比顺铂更优越，比已报道的结构类似的咔啉类钌配合物活性高出近30倍；实施例数据还显示，所述的钌配合物可以诱导肿瘤细胞的凋亡、能阻滞细胞周期、以及能诱导肿瘤细胞线粒体膜电位损伤。

附图说明

图1为目标化合物[Ru(bpy)₂₍1-Ph-βC)]⁺的合成路线图。

图2为为目标化合物[Ru(bpy)₂₍1-Ph-βC)]⁺的ESI-MS图以及紫外吸收光谱图。

图3为目标化合物[Ru(dmb)₂(1-Ph-βC)]⁺的合成路线图。

图4为目标化合物[Ru(dmb)₂(1-Ph-βC)]⁺的ESI-MS图以及紫外吸收光谱图。

图5为AO/EB和Hoechst33324染色测试目标化合物诱导HeLa细胞凋亡图。

图6为目标化合物对HeLa细胞周期的阻滞。

图7为JC-1染色检测目标化合物诱导HeLa细胞线粒体膜电位损伤。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

实施例1[Ru(bpy)₂(1-Ph-βC)](PF₆)(简称Ru 1)的制备

(1)色胺盐酸盐的合成

色氨(0.64g，4.0mmol)溶于甲醇中，冰浴下缓慢滴加氯化亚砜(0.20～0.32g，2.0～3.2mmol)，滴加完毕，恢复至室温下反应30min，过滤得盐酸盐固体，再将滤液减压蒸馏去溶剂，所得固体用乙酸乙酯漂洗，烘干后得到白色盐酸盐固体，产率为85.3％。

(2)1-Ph-4H-βC的合成

在50ml反应管中将色胺盐酸盐(0.78g，4mmol)与苯甲醛(0.508g，4.8mmol)在10mL分子筛干燥的乙腈中混匀。80℃回流13h，冷却至室温，TLC跟踪反应结束。观察到如果有沉淀生成，以石油醚和乙酸乙酯的混合液按照2:1过滤；如果没有观察到沉淀，旋干样品，随后，加入5mL 10％的碳酸钾溶液在100℃下回流，充分搅拌，冷却后用乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水MgSO₄干燥，蒸干溶剂得产品，产率为89.7％。

(3)1-Ph-N-Ts-4H-βC的合成

将1-Ph-4H-βC(0.20g，0.8mmol)与三乙胺按照摩尔比为1:2加入到二氯甲烷中，-10℃下慢慢加入对甲苯磺酰氯(0.152g，0.8mmol)，滴加完毕后，恢复室温反应3h，TLC跟踪，至到原料点消失。旋干二氯甲烷，乙酸乙酯10mL溶解固体，先用HCl萃取洗涤，再用碳酸钠萃取洗涤。无水硫酸镁干燥，抽滤，旋干，石油醚淋洗固体，抽滤，得粗产品，产率：82.1％。

(4)主配体1-Ph-βC的合成

将1-Ph-N-Ts-4H-βC(0.22g，0.5mmol)溶于含有30％NaOH的DMSO溶液中，120℃加热回流，TLC跟踪反应结束，待恢复至室温，加入30mL水搅拌反应30min，过滤，沉淀，用水漂洗3次，干燥得粗产品，产率为80.2％。

(5)cis-[Ru(bpy)₂(Cl)₂]·2H₂O的合成

在50mL的三口瓶中：将bpy(0.62g，4mmol)、氯化锂(1.26g，30mmol)、三氯化钌(0.6g,2mmol)于DMF中混匀，在氩气保护下加热140℃回流反应8h。停止反应后，冷却到室温，加入丙酮，在-4℃放置过夜，抽滤，得到紫黑色晶体。以冰水、丙酮淋洗晶体，真空干燥，得到紫黑色晶体，产率82.5％。

(6)Ru 1的合成

将cis-Ru(bpy)₂Cl₂·2H₂O(0.106g，0.2mmol)和2.5倍量三氟甲磺酸银(0.128g，0.5mmol)溶于15mL分子筛干燥过的无水乙醇中，在氩气保护下80℃加热回流反应3h。然后加入1倍量1-Ph-βC(0.0488g，0.2mmol)，80℃下加热回流反应过夜。待反应冷却至室温，加入NH₄PF₆除去溶液中溶解的杂质，将析出的晶体干燥，用少量乙腈溶解，以甲苯：乙腈(2：1，v/v)为洗脱剂氧化铝柱层析纯化，产率：82.1％。结构式如式1所示。C₃₇H₂₇F₆N₆PRu理论值：C 55.43％，H 3.39％，N 10.48％；实验值：C 55.37％，H 3.37％，N 10.53％。ESI-MS(CH3OH)：C37H27N6Ru+[M-PF6]+m/z理论值657.13，实验值657.06。

实施例2[Ru(dmb)₂(1-Ph-βC)](PF₆)(简称Ru 2)的制备

(1)色胺盐酸盐的合成

同实施例1。

(2)1-Ph-4H-βC的合成

同实施例1。

(3)1-Ph-N-Ts-4H-βC的合成

同实施例1。

(4)主配体1-Ph-βC的合成

同实施例1。

(5)cis-[Ru(dmb)₂(Cl)₂]·2H₂O的合成

在50mL的三口瓶中：将dmb(0.73g,4mmol)、氯化锂(1.26g,30mmol)、三氯化钌(0.6g,2mmol)于DMF中混匀，在氩气保护下140℃加热回流反应8h。停止反应后，冷却到室温，加入丙酮，在-4℃放置过夜，抽滤，得到紫黑色晶体，并以冰水、丙酮淋洗晶体，真空干燥，得到紫黑色晶体，产率85.7％。

Ru 2的合成。

(6)Ru 2的合成

将cis-Ru(dmb)₂Cl₂·2H₂O(0.108g，0.2mmol)和2.5倍量三氟甲磺酸银(0.128g，0.5mmol)溶于15mL分子筛干燥过的无水乙醇中，在氩气保护下80℃加热回流3h，然后加入1倍量1-ph-bc(0.0488g，0.2mmol)，在80℃下继续加热回流反应过夜。待反应冷却至室温，加入NH₄PF₆除去溶液中溶解的杂质，将析出的晶体干燥，用少量甲醇溶解，以甲苯：乙腈(2：1，v/v)为洗脱剂氧化铝柱层析纯化，产率：81.8％。结构式如式2所示。C₄₁H₃₅F6N6PRu理论值：C 57.41％，H 4.11％，N 9.80％；实验值：C 57.21％，H 4.01％，N 9.92％。ESI-MS(CH3OH)：C41H35N6Ru+[M-PF6]+m/z理论值713.20，实验值713.21。

实施例3本发明所述钌配合物体外毒性试验

待测试的肿瘤细胞：肿瘤细胞A549(肺癌细胞)、HeLa(宫颈癌细胞)、NCl-H460(非小细胞肺癌细胞)、HepG-2(肝癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)。

细胞毒性实验：采用MTT法研究了化合物的体外细胞毒性，具体操做如下：先将胰酶消化的肿瘤细胞稀释为5～10×10⁴个/mL，取含肿瘤细胞的培养液0.1mL于96孔细胞培养板中，然后将接种好的细胞板在37℃，5％的CO₂培养箱中培养24h。将长满单层细胞培养板弃液加入不同浓度的化合物(Ru 1与Ru 2的浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μM，顺铂的浓度分别为2.0、4.0、8.0、16.0、、32.0、64.0、128.0μM)，并设对照组(细胞培养板中加入0.1mL培养基)，放入37℃，5％CO₂的培养箱中培养48h后，吸去培养液，用PBS洗涤一次。每孔加20L 5mg/mL的MTT染料液，在37℃，5％CO₂的培养箱中培养4h后，随后加入三联液100L每孔并混匀，37℃放置过夜以溶解甲臢，用酶标仪在490nm处检测各孔OD值。计算50％细胞存活时化合物的浓度(IC₅₀)。由下表1可知，两个咔啉环金属化钌配合物表现出比顺铂(Cisplatin)更优越的抗肿瘤活性，比已报道的结构类似的咔啉类钌配合物活性高出近30倍(Tan,等，J.Med.Chem.2010,53,7613–7624)。

表1本发明所述钌配合物体对肿瘤细胞的IC₅₀值

*1-Py-βC＝1-(2-pyridyl)-β-carboline)，[Ru(bpy)₂(1-Py-βC)](PF₆)₂的IC₅₀数据来自文献Tan,等，J.Med.Chem.2010,53,7613–7624。

实施例4，本发明所述钌配合物诱导HeLa细胞凋亡试验

细胞凋亡实验具体步骤如下：将细胞接种于60mm的Corning培养皿中，12h后，加入不同浓度药物进行处理24h，细胞用4％多聚甲醛于4℃固定30min(AO/EB染色细胞不用固定)，用预冷的PBS洗涤两次。AO/EB、Hoechst 33324常温下染色10min，随后用预冷的PBS洗涤两次，荧光显微镜下观察，其细胞凋亡如附图5。结果表明配合物Ru 1、Ru 2能够显著的诱导HeLa细胞凋亡。

实施例5本发明所述钌配合物诱导HeLa细胞周期阻滞试验

细胞周期实验具体步骤如下：将细胞以1×10⁵个接种于六孔板中，培养12h后加入不同浓度药物进行处理，经过24h后，细胞用胰蛋白酶消化，并用预冷的PBS洗涤两次，75％乙醇-20℃固定过夜，离心去除固定液再加入40L的RNAse(50g/mL)和20L的碘化丙啶(PI，50g/mL)，于37℃、5％的CO₂培养箱中孵化30min，立即采用流式细胞仪进行分析，每个样品收集的细胞数为1×10⁴个。化合物对HeLa细胞周期阻滞图如图6所示，结果表明目标配合物能够诱导HeLa细胞发生G0/G1期周期阻滞。

实施例6本发明所述钌配合物诱导HeLa细胞线粒体膜电位损伤试验

线粒体膜电位检测具体步骤如下：将细胞以1×10⁵接种于六孔板中，培养12h后加入不同浓度药物进行处理，经过24h后，细胞用胰蛋白酶消化，并用预冷的PBS洗涤两次，离心后再加入250L的线粒体荧光探针JC-1在37℃、5％的CO₂培养箱中孵化30min，立即采用流式细胞仪进行分析，每个样品收集的细胞数为1×10⁴个。实验结果如图7所示，结果表明目标配合物能够诱导HeLa细胞线粒体膜电位降低。