一种细黄链霉菌及微生物肥料及其应用的制作方法

本发明属于微生物工程领域，更具体地说是涉及一种细黄链霉菌及微生物肥料及其应用。

背景技术：

植物根际促生菌(Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)指生存于植物根系范围之内，并能直接或者间接的对植物生长有调节作用或对病原菌有拮抗作用的有益菌的统称。在早先的研究中，PGPR多数都是细菌所属，随着近年来研究技术的发展，不仅在原核微生物中发现某些放线菌，而且真核微生物的许多真菌也报道具有促生作用，但仍用PGPR来泛指。可见PGPR在研究发展进程中，其内涵和外延都不断得以丰富和扩展。

链霉菌(Streptomycetaceae)是抗生素类物质的主要生产菌，在微生物产生的20000多种活性物质中，链霉菌占到60％以上，是一类作物有益菌。细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)作为链霉菌属(Streptomyces)内的一个种类，在自然栽培条件下，其自身代谢产物可有效地促进植物生长，细黄链霉菌可产生玉米素、激动素等有效活性成分，已广泛应用于果树、蔬菜等多种植物栽培上，并对蔬菜等作物具有明显的促生、抗病作用。由链霉菌产生的抗生素能够抑制多种植物病原菌的生长，因此链霉菌具有防治作物病虫害的作用。

技术实现要素：

本发明提出了一种细黄链霉菌，从番茄种植大棚中患病番茄根系土壤中分离筛选出一种放线菌，经鉴定为细黄链霉菌，经试验表明此菌株具有拮抗作物的连作障碍，以此菌株为主要功能性菌株的微生物肥料，并有促进作物生长和提高产量的作用。

本发明具体是通过以下技术方案来实现的：

一种细黄链霉菌菌株，2016年8月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：菌株F-23(Streptomyces microflavus)，保藏号：CCTCC M 2016428。

一种功能菌为菌株F-23的微生物肥料。

微生物肥料中菌株的活菌量至少为2.0×10⁷CFU/g。

此肥料具有拮抗作物连作障碍、促进作物生长以及提高产量的功效。

本发明产生的有益效果为：本发明丰富了微生物肥料菌种资源，拓宽微生物肥料在促进植物生长，拮抗植物病原菌等多方面的功能化发展。本技术将对提高作物产量和品质，促进农业可持续发展、减少环境污染以及保障人类健康都有重要的理论和实践意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1稻瘟病病菌做指示菌抑制病原菌的效果，其中B：12h接种F-23，C：24h接种F-23。

图2棉黄萎病菌做指示菌抑制病原菌的效果，其中D：12h接种F-23，E：24h接种F-23。

图3为菌株F-23在分离纯化平板的状态图。

图4为菌株F-23在涂布计数平板的状态图。

图5为显微镜下菌株F-23的菌丝状态图。

图6实验组40d地上部鲜重。

图7实验组40d地上部干重。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：一株细黄链霉菌，其筛选过程如下：

1)菌株的分离纯化

土壤样品来自湖北省农科院蔬菜研究所种植的番茄大棚。

除去地表植物残体和表层土2cm-10cm，分别从30株患病番茄根系土壤中采集5g-10g样品，放入样品袋中。经阴干后，采用四分法将土壤样品缩分至约10g左右；然后置于含有150ml灭菌PB缓冲液的500ml三角瓶中；30℃、180rpm震荡30min，静置沉淀(或1500rpm-5000rpm离心5min)，取上清液；取100ml上清液，经15-25℃、8000rpm-20000rpm离心10min，取沉淀；将沉淀悬浮于50ml灭菌PB缓冲液中再次15-25℃、8000rpm-20000rpm离心10min；重复两次以后，将沉淀悬浮于10ml的无菌水中，制得土壤悬浮液。将此悬浮液稀释至合适梯度后涂布于含有24ug/mlK₂Cr₂O₇的高氏1号分离培养基平板上，28℃—35℃倒置培养；挑取差异化明显的、不同类型的典型菌落分别进行分离纯化，将纯化后的菌株编号并保存。此次共分离纯化出34株不同的菌株，分别编号为F-1，F-2，……F-34。

2)拮抗菌株的筛选

表1分离菌株抑菌圈直径

对所筛选的34株菌进行复筛验证抑制病原菌的效果如表1所示，有5株菌的抑菌圈直径总和在80mm以上，证明其对所用指示菌的综合抑制作用比较好。其中菌株F-23抑制病原菌的效果最好，对稻瘟病病菌、立枯丝核菌、棉黄萎病菌及禾谷镰刀菌的抑菌圈直接分别为48mm、32mm、19mm及30mm。

3)高产IAA菌株的复筛

采用含有L-色氨酸(200mg/L)的R2A液体培养基。将拮抗复筛后的5株菌株接种于筛选培养基，30℃，180rpm摇床培养2d。取50ul菌悬液滴于白色陶瓷板上，同时加50ul Salkowski比色液。将加入50ul浓度为50mg/L的IAA比色液作为阳性对照，白色陶瓷板于室温(20℃)避光放置30min后观察，颜色变红者表示能够分泌IAA。对复筛获得的分泌IAA的菌株进行定量测定，培养条件同上。将菌悬液10000rpm离心10min，取上清液加入等体积Salkowski比色液，避光静置30min测定其OD₅₃₀值。每株菌设置3个平行。标准曲线采用分析纯的IAA梯度稀释，按照同样的方法测定OD值绘制。

经过产IAA的定性筛选，5株菌株中都产IAA。5株菌采用色氨酸发酵培养基发酵48h，测定发酵液中IAA的含量。其中F-23的IAA产量最高，达到27.59mg/L。将筛选出的菌株F-23利用平板划线法纯化后，保存于营养琼脂的斜面培养基上。

4)菌株的形态观察及16SrDNA分子学鉴定

菌株F-23在高氏1号固体培养基上于30℃恒温培养箱中培养七天以后，如图3、图4所示，菌落为白色且明显突出、表面绒毛状、菌丝未看到明显色素产生。在显微镜下观察菌株F-23的形态特征，发现气生菌丝发育良好，孢子链呈直线型；基内菌丝则交织呈网状，多分枝，但无隔膜、无断裂；如图5所示，气生菌丝呈弯曲、螺旋状，孢子丝由气生菌丝发育而来通过，成熟孢子从孢子丝脱落后观察到其呈圆形至杆状。

并进一步进行16SrDNA基因序列测序，将测定所得序列与NCBI数据库BLAST同源性比对分析，选取同源性较高的模式菌株与菌株序列用ClustalX1.81软件进行多序列比对分析，用软件MegAlign5.2中的邻接法(Neighbor-Joining method)构建系统发育树。根据16SrDNA的系统发育树分析，初步鉴定菌株F-23为链霉菌属中的细黄链霉菌。

实施例2：微生物肥料的制作

比例1：原始有机肥(总养分：5％，有机质：45％，水分：25％；下同。)中添加菌株F-23发酵培养基(菌株F-23计数为10亿/g)质量比为500:1，即肥料中含有菌株F-23的量为0.02亿/g。

比例2：原始有机肥中添加菌株F-23培养基质量比为50:1，即肥料中含有菌株F-23的量为0.2亿/g。

比例3：原始有机肥中添加菌株F-23培养基质量比为5:1，即肥料中含有菌株F-23的量为2亿/g。

实施例3：微生物肥料应用效果

按实施例2中的3种配方，分别制作四种含有不同含量菌株F-23的微生物肥料。以此肥料为实验肥料，分别在花盆及田间对其抗病、及促生长中的作用进行探讨。

1)微生物肥料对大棚种植番茄的应用

上述不同比例微生物肥料的编号依次为T1-T3；对照(CK)组施用未添加菌株F-23的原始肥料。大棚内实验组与对照组土地均使用塑料薄膜互相隔开，防止各组之间肥水渗透互相影响；番茄种植株距30cm，种植密度51300株/公顷。实验组与对照组除施用有机肥的区别外，其他田间管理一致。供试大棚的土壤采用NY/T 1121土壤检测系列标准中所规定的方法进行检测，供试大棚土壤指标如下：

表2供试大棚土壤基本性状

在番茄定植40d后称量番茄苗地上部及根部鲜重，测定主根长，采用排水法测定根系体积，烘干后称量根系及地上部干重。结果见表3及图6、图7。

表3番茄根系生长情况

每组随机取10株调查单株坐果数、平均单果质量，测量收获果实质量，统一折算为每公顷产量。结果见表4。

表4实验组番茄经济性状及产量

盛果期每组随机采取第2穗成熟度一致、大小均一的三个商品果，采用碘量法测定VC含量、蒽酮比色法测定可溶性糖含量、手持折光仪测定果实可溶性固形物含量、滴定法测定可滴定酸含量、紫外分光光度法测定番茄红素含量、水杨酸法测定硝酸盐含量。结果见表5。

表5实验组番茄品质状况

由上述实验结果可以看出，T2实验组处理的番茄植株，在根长、侧根数量、根体积、根干鲜重等均优于其他组，并且所有实验组的结果都优于对照组。

从产量来看，T2实验组高达176781.48kg/hm²，与对照组相比较增产了10.14％，为实验组中效果最优。并且T1和T3实验组也比对照组差异显著，分别较对照增产9.71％和7.80％。

从番茄品质状况的表格中可以看出，T1～T3实验组与CK对照组相比较，VC、可溶性糖、可溶性固形物、番茄红素的含量均比较高；而可滴定酸、硝酸盐含量均显著低于对照组。综合各个指标，以T2实验组最优，其VC含量为312.6mg/kg，可溶性糖为4.42％，可溶性固形物为5.3％，番茄红素为28.88ug/g，分别比CK对照组高14.4％、9.1％10.4％和23.7％，其可滴定酸与硝酸盐含量分别较CK对照组低19.3％和31.5％。

微生物肥料对番茄根系和植株生长的促进作用较对照组都比较明显，并且在产量和果实品质方面也优于对照组。这说明微生物肥料能满足番茄生长过程中对肥料的需求，又能克服单纯使用有机肥肥效慢的缺点。在实验过程中发现过高菌株F-23含量的肥料并不能更好的提高产量和品质，可能是过高的菌株F-23生命活动分泌了过多的抗生素，过高的抗生素浓度影响到了其他有益菌的生长，从而影响到了植株的生长和果实的品质。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。