一种修复土壤生态系统的微生物修复剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种修复土壤生态系统的微生物修复剂，以巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌和酵母菌作为主体菌，以乳酸菌、细黄链霉菌作为辅助菌，将发酵完成的各菌种按照以下活菌数比例混合均匀得到液体微生物修复剂，巨大芽孢杆菌50-60，地衣芽孢杆菌40-50，丁酸梭菌30-50，酵母菌20-50，乳酸菌1-2，细黄链霉菌1，液体微生物修复剂与固体吸附物混合均匀后即得固体微生物修复剂；本发明的微生物修复剂在进入土壤生态系统后，可以与土著的有益微生物共同形成优势菌群，促进土壤生态系统的氮、氧循环，从而达到修复土壤生态系统，使之形成新的稳定的平衡生态系统，改善农作物的生长环境，提高农作物的质量和产量。
【专利说明】—种修复土壤生态系统的微生物修复剂
【技术领域】
[0001]本发明属于土壤生态系统修复领域，特别是一种用于土壤生态系统修复的微生物土壤修复剂及其制备方法，以及该微生物土壤修复剂在修复土壤中的应用。
【背景技术】
[0002]随着工农业发展，土壤资源承受了越来越大的压力，由于大量化肥、农药的使用及重金属污染，放射性污染使得土壤中难降解的有机物日益增多，从而导致土壤微生物种类和数量减少、土壤结构及生态系统破坏、农作物品质下降、病虫害增加，土壤生态系统被破坏。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种修复土壤生态系统的微生物修复剂；
本发明另一目的是提供一种制备修复土壤生态系统的微生物修复剂的方法；本发明再一目的是将上述的微生物修复剂应用于土壤修复，促进作物生长。
[0004]本发明的目的是通过以下技术方案实现的，一种修复土壤生态系统的微生物修复剂，其特征在于，以巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌和酵母菌作为主体菌，以乳酸菌、细黄链霉菌作为辅助菌，将发酵完成的各菌种按照以下活菌数比例混合均匀得到液体微生物修复剂，巨大芽孢杆菌50-60，地衣芽孢杆菌40-50，丁酸梭菌30-50，酵母菌20-50，乳酸菌1-2，细黄链霉菌1，混合菌液中的有效活菌数> 3亿/毫升。
[0005]进一步地，所述液体微生物修复剂与固体吸附物按照I升:5~10千克的体积重量比混合均匀后即得固体微生物修复剂。
[0006]进一步地，所述固体吸附物为草炭土和蛭石的混和物，经粉碎、高温消毒后制得。
[0007]进一步地，所述主体菌的有效活菌数> 3亿/毫升；所述辅助菌的有效活菌数^ 1000万/毫升。
[0008]一种制备上述修复土壤生态系统的微生物修复剂的方法，包括以下步骤:
(1)分别用固体培养基复苏巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、酵母菌、乳酸菌和细黄链霉菌，并挑选出单克隆菌落；
(2)将挑选出的巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、酵母菌、乳酸菌和细黄链霉菌的单克隆菌落分别接种在一级液体培养基中，获得液体菌种；
(3)分别将巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、酵母菌、乳酸菌和细黄链霉菌的液体菌种在二级培养培养基中，放大培养；
(4)分别将巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、酵母菌、乳酸菌和细黄链霉菌经放大培养的菌液接种到发酵罐中发酵培养，得到生产用菌液；
(5)将生产用菌液按照活菌数比例配比，混合均匀得到液体微生物修复剂；
(6)草炭土和蛭石粉碎，经高温灭菌，冷却至室温后，将上述液体微生物修复剂喷洒在其上，充分吸收混合均匀后即得到固体微生物修复菌剂。[0009]上述修复土壤生态系统的微生物修复剂在修复土壤中的应用，包括用于作物种植前基施或/和作物种植后追施。
[0010]上述微生物修复剂中各种微生物发酵液均可以按照常规方法制备，将购买到的菌种接种到固体培养基上进行复苏培养，菌体生长后，挑取单克隆；将单克隆接种到小量液体培养基中培养(一级培养)，得到液体菌种；将液体菌种接种到中量液体培养基中进行放大培养(二级培养)；放大培养后的菌种在接种到发酵罐中发酵培养，最终得到所要菌种的液体菌剂。对于该发明中涉及到的微生物，可以参考以下的方法制备:
下述的各种配方均为菌体液体培养基配方，固体培养基是在一级液体培养基的基础上加入2%琼脂。具体就是在一级液体培养基中加入2%的琼脂，加热至100°C溶解，40°C下冷却并凝固，使其成为固体状态即为固体培养基。所有的培养基均在120oC高温高压灭菌处理30分钟。
[0011](一)巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium, ATCC 14581，ATCC 编号为美国典型培养物保藏中心编号):
(I)复苏活化、挑取单克隆:将购买的菌种接种到固体培养上，37°C静置培养24小时。固体培养的配方是琼脂2%，牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.2%，葡萄糖0.5%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为7.0。将上述混合物，在120°C高温高压灭菌处理30分钟，40°C下冷却并凝固。
[0012](2) 一级培养，得到液体菌种:将单克隆菌落接种到一级液体培养基中，37°C摇床培养，转速为200转/分钟，过夜培养后得到液体菌种。其中一级液体培养基配方为牛肉膏
0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.2%，葡萄糖0.5%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为
7.0。培养基在120oC高温高压灭菌处理30分钟。
[0013](3) 二级培养、放大培养:将液体菌种接种到二级液体培养基中，37°C摇床培养，转速为200转/分钟，过夜，进行放大培养。其中二级液体培养基配方为牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.2%，葡萄糖0.5%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为7.0。培养基在120°C高温高压灭菌处理30分钟。
[0014](4)发酵培养:将放大培养得到的菌种接种到发酵罐中进行发酵培养。其中发酵罐培养基配方为淀粉0.5%，蛋白胨0.5%，蔗糖1%，氯化钠0.2%，磷酸二氢钾0.03%,磷酸氢二钾0.015%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为7.0。培养基在120oC高温高压灭菌处理30分钟。
[0015](二)地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis, ATCC 11946):
(I)复苏活化、挑取单克隆:将购买的菌种接种到固体培养上，37°C静置培养24小时。固体培养的配方是琼脂2%，牛肉膏3%，蛋白胨1%，氯化钠0.1%，葡萄糖0.5%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为7.5。将上述混合物，在120oC高温高压灭菌处理30分钟，40°C下冷却并凝固。
[0016](2) 一级培养，得到液体菌种:将单克隆菌落接种到一级液体培养基中，37°C摇床培养，转速为200转/分钟，过夜培养后得到液体菌种。其中一级液体培养基配方为牛肉膏3%，蛋白胨1%，氯化钠0.1%，葡萄糖0.5%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为
7.5。培养基在120°C高温高压灭菌处理30分钟。
[0017](3) 二级培养、放大培养:将液体菌种接种到二级液体培养基中，37°C摇床培养，转速为200转/分钟，过夜，进行放大培养。其中二级液体培养基配方为牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.1%，葡萄糖0.5%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为7.5。培养基在120°C高温高压灭菌处理30分钟。
[0018](4)发酵培养:将放大培养得到的菌种接种到发酵罐中进行发酵培养。其中发酵罐培养基配方为淀粉0.5%，蛋白胨0.5%，豆饼粉浸汁1%，蔗糖1%，氯化钠0.2%，磷酸二氢钾
0.03%，磷酸氢二钾0.02%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为7.5。培养基在120°C高温高压灭菌处理30分钟。
[0019](三)丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum, ATCC 25755):
(I)复苏活化、挑取单克隆:将购买的菌种接种到固体培养上，37°C静置培养24小时。固体培养的配方是琼脂2%，牛肉膏3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，葡萄糖0.3%，硫酸铵0.01%,硫酸锰0.01%,硫酸镁0.005%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为6.8。将上述混合物，在120°C高温高压灭菌处理30分钟，40°C下冷却并凝固。
[0020](2) 一级培养，得到液体菌种:将单克隆菌落接种到一级液体培养基中，37°C培养，得到液体菌种。其中一级液体培养基配方为牛肉膏3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，葡萄糖
0.3%，硫酸铵0.01%，硫酸锰0.01%，硫酸镁0.005%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为6.8。培养基在120°C高温高压灭菌处理30分钟。
[0021](3) 二级培养、放大培养:将液体菌种接种到二级液体培养基中，37°C进行放大培养。其中二级液体培养基配方为牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，葡萄糖0.3%，硫酸铵
0.01%，硫酸锰0.01%,硫酸镁0.005%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为6.8。培养基在120°C高温高压灭菌处理30分钟。
[0022](4)发酵培养:将放大培养得到的菌种接种到发酵罐中进行发酵培养。其中发酵罐培养基配方为酵母粉0.5%，蛋白胨0.5%，豆饼粉浸汁1%，蔗糖1%，氯化钠0.5%，硫酸铵
0.01%，硫酸锰0.01%，硫酸镁0.005%，碳酸钙0.01%，磷酸二氢钾0.02%，磷酸氢二钾0.01%,用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为6.8。培养基在120°C高温高压灭菌处理30分钟。
[0023](四)酵母菌(Saccharomycescerevisiae, ATCC 16664):
(O复苏活化、挑取单克隆:将购买的菌种接种到固体培养上，28°C静置培养。固体培养的配方是琼脂2%，酵母提取物0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，葡萄糖0.3%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为6.8。将上述混合物，在120°C高温高压灭菌处理30分钟，40°C下冷却并凝固。
[0024](2)—级培养，得到液体菌种:将单克隆菌落接种到一级液体培养基中，28°C培养，得到液体菌种。其中一级液体培养基配方为酵母提取物0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，葡萄糖0.3%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为6.8。培养基在120oC高温高压灭菌处理30分钟。
[0025](3) 二级培养、放大培养:将液体菌种接种到二级液体培养基中，28°C进行放大培养。其中二级液体培养基配方为酵母提取物1%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，葡萄糖0.5%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为6.8。培养基在120°C高温高压灭菌处理30分钟。
[0026](4)发酵培养:将放大培养得到的菌种接种到发酵罐中进行发酵培养。其中发酵罐培养基配方为酵母粉0.5%，蛋白胨0.5%，豆饼粉浸汁1%，蔗糖1%，氯化钠0.5%，磷酸二氢钾0.04%，磷酸氢二钾0.01%,碳酸钙0.1%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为6.8。培养基在120°C高温高压灭菌处理30分钟。
[0027](五)乳酸菌(Lactobacilluspi ant arum, ATCC 8014):
(I)复苏活化、挑取单克隆:将购买的菌种接种到固体培养上，37°C静置培养24小时。固体培养的配方是琼脂2%，牛肉膏0.5%，酵母提取物0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，葡萄糖0.3%,乙酸钠0.05%，柠檬酸二胺0.02%，硫酸亚铁0.01%，磷酸二氢钾0.03%，磷酸氢二钾
0.02%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为7.2。将上述混合物，在120°C高温高压灭菌处理30分钟，40°C下冷却并凝固。[0028](2) 一级培养，得到液体菌种:将单克隆菌落接种到一级液体培养基中，37°C培养，得到液体菌种。其中一级液体培养基配方为牛肉膏0.5%，酵母提取物0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，葡萄糖0.3%，乙酸钠0.05%,柠檬酸二胺0.02%,硫酸亚铁0.01%,磷酸二氢钾
0.03%，磷酸氢二钾0.02%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为7.2。培养基在120°C高温高压灭菌处理30分钟。
[0029](3) 二级培养、放大培养:将液体菌种接种到二级液体培养基中，37°C进行放大培养。其中二级液体培养基配方为牛肉膏1%，酵母提取物0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，葡萄糖0.3%,乙酸钠0.05%，柠檬酸二胺0.02%，硫酸亚铁0.01%，磷酸二氢钾0.03%，磷酸氢二钾
0.02%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为7.2。培养基在120°C高温高压灭菌处理30分钟。
[0030](4)发酵培养:将放大培养得到的菌种接种到发酵罐中进行发酵培养。其中发酵罐培养基配方为可溶性淀粉0.5%，酵母提取物0.5%，蛋白胨0.5%，蔗糖1%，氯化钠0.5%，乙酸钠0.05%，柠檬酸二胺0.02%，硫酸亚铁0.01%，磷酸二氢钾0.03%，磷酸氢二钾0.02%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为6.8。培养基在120oC高温高压灭菌处理30分钟。
[0031](六)细黄链霉菌(Streptomycesmicroflavus, ATCC 23877 ):
(I)复苏活化、挑取单克隆:将购买的菌种接种到固体培养上，37°C静置培养24小时。固体培养的配方是牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，葡萄糖0.3%，磷酸二氢钾0.03%,磷酸氢二钾0.02%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为7.0。将上述混合物，在120°C高温高压灭菌处理30分钟，40°C下冷却并凝固。
[0032](2)—级培养，得到液体菌种:将单克隆菌落接种到一级液体培养基中，37°C培养，得到液体菌种。其中一级液体培养基配方为牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，葡萄糖0.3%，磷酸二氢钾0.03%,磷酸氢二钾0.02%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为
7.0。培养基在120°C高温高压灭菌处理30分钟。
[0033](3) 二级培养、放大培养:将液体菌种接种到二级液体培养基中，37°C进行放大培养。其中二级液体培养基配方为牛肉膏1%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，葡萄糖0.3%，磷酸二氢钾0.03%,磷酸氢二钾0.02%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为7.0。培养基在120°C高温高压灭菌处理30分钟。
[0034](4)发酵培养:将放大培养得到的菌种接种到发酵罐中进行发酵培养。其中发酵罐培养基配方为可溶性淀粉0.5%，蛋白胨0.5%，蔗糖1%，氯化钠0.5%，乙酸钠0.05%，磷酸二氢钾0.03%,磷酸氢二钾0.02%，用蒸馏水溶解，用水补足至100%，调节pH值为7.2。培养基在120°C高温高压灭菌处理30分钟。[0035]本发明的微生物修复剂在进入土壤生态系统后，可以与土著的有益微生物共同形成优势菌群，促进土壤生态系统的氮、氧循环，从而达到修复土壤生态系统，使之形成新的稳定的平衡生态系统，改善农作物的生长环境，提高农作物的质量和产量。
【具体实施方式】
[0036]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0037]本发明提及的一种修复土壤生态系统的微生物修复剂的制备方法，包括以下步骤:
(1)分别用固体培养基复苏巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、酵母菌、乳酸菌和细黄链霉菌，挑选单克隆菌落；
(2)分别将巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、酵母菌、乳酸菌和细黄链霉菌接种在一级液体培养基中，获得液体菌种；
(3)分别将巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、酵母菌、乳酸菌和细黄链霉菌的液体菌种在二级培养培养基中，放大培养；
(4)分别将巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、酵母菌、乳酸菌和细黄链霉菌的放大培养的菌液接种到发酵罐中发酵培养，得到生产用菌液；
(5)将菌液按照比例混合得到液体微生物修复剂；
(6)将液体微生物修复剂与草炭土和蛭石等多孔物质得到固体微生物修复菌剂。
[0038]实施例1:`
1、制备液体微生物修复剂:将已经发酵完成的各菌种按照以下活菌数比例混合，巨大芽孢杆菌:地衣芽孢杆菌:丁酸梭菌:酵母菌:乳酸菌:细黄链霉菌=50:50:50:50:1:1 ;混合均匀，即得到液体微生物修复剂；
2、将草炭土和蛭石粉碎，经高温消毒后，作为固体吸附物；
3、将1份体积(单位:升)液体微生物修复剂，喷洒在5份质量(单位:千克)的固体吸附物上，混合均匀，即得到固体微生物修复剂。
[0039]实施例2:
1、制备液体微生物修复剂:将已经发酵完成的各菌种按照以下活菌数比例混合，巨大芽孢杆菌:地衣芽孢杆菌:丁酸梭菌:酵母菌:乳酸菌:细黄链霉菌=50:50:30:30:1:1 ;混合均匀，即得到液体微生物修复剂；
2、将草炭土和蛭石粉碎，经高温消毒后，作为固体吸附物；
3、将1份体积(单位:升)液体微生物修复剂，喷洒在7.5份质量(单位:千克)的固体吸附物上，混合均匀，即得到固体微生物修复剂。
[0040]实施例3:
1、制备液体微生物修复剂:将已经发酵完成的各菌种按照以下活菌数比例混合，巨大芽孢杆菌:地衣芽孢杆菌:丁酸梭菌:酵母菌:乳酸菌:细黄链霉菌=60:40:40:20:2:1 ;混合均匀，即得到液体微生物修复剂；
2、将草炭土和蛭石粉碎，经高温消毒后，作为固体吸附物；
3、将1份体积(单位:升)液体微生物修复剂，喷洒在10份质量(单位:千克)的固体吸附物上，混合均匀，即得到固体微生物修复剂。[0041 ] 试验例1:本发明固体微生物修复剂的应用效果试验
1、供试样品:实施例1-3所制备的微生物修复剂
2、试验方法:该试验在温室中利用盆栽种植油菜完成。具体步骤如下:(I)将油菜根肿病病根磨碎，并与营养土按照重量比1:50的比例混合，得到菌土混合物；(2)将菌土混合物分为4组，第一、二、三组分别加入实施例1、2、3所制备的微生物修复剂，加入比例为1份微生物修复剂加入到50份的菌土混合物，混合均匀；第四组不加入任何微生物修复剂和其它物质，作为对照；(3)分别在四组中播种50粒油菜种子，待发芽两天后，每组间苗，留下36棵；(4)四组油菜在温室中培养，光周期为16L:8D (光照16小时，无光照8小时)，相对湿度70%，温室室温为30°C ；(5)发芽6周后，带根收取油菜，去除根部土壤后测量根部根肿病的发病情况，并测量植物的株高、地上部分鲜重，计算平均值和标准误差，用单因素方差分析(one-way ANOVA)方法进行统计学上差异性显著分析,设定P〈0.05时有显著性差异。
[0042]3、试验结果:根肿病的发病情况按照5级法进行计数统计分析:0级，根系正常、无病害症状；1级，须根、侧根个别细小根瘤，主根未发生病害；3级，须根、侧根较多根瘤或根瘤直径或长度超过0.5厘米，或主根出现病害症状但肿大不明显；5级，主根肿大明显，肿大部分直径为茎基2-3倍；7级，主根肿大明显，肿大部分直径为茎基3倍以上。病情指数按照以下公式计算:病情指数=[Σ (各级病株数X相应级别)+ (调查总株数X发病最高级别代表值)]X100。试验结果表明，与发病对照组(第四组)相比，施用了本发明的微生物修复剂的第一、二、三组，油菜根肿病的发病率和病情指数都显著下降，防止效果达到68%以上；与此同时施用了微生物修复剂的油菜株高和鲜重较发病组增长显著，具体数据见下表(株高和鲜重的数值为平均值土标准误差)；而第一、二、三组之间没有显著差异。
【权利要求】
1.一种修复土壤生态系统的微生物修复剂，其特征在于，以巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌和酵母菌作为主体菌，以乳酸菌、细黄链霉菌作为辅助菌，将发酵完成的各菌种按照以下活菌数比例混合均匀得到液体微生物修复剂，巨大芽孢杆菌50-60，地衣芽孢杆菌40-50，丁酸梭菌30-50，酵母菌20-50，乳酸菌1_2，细黄链霉菌1，混合菌液中的有效活菌数≥3亿/毫升。
2.根据权利要求1所述的一种修复土壤生态系统的微生物修复剂，其特征在于，所述液体微生物修复剂与固体吸附物按照I升:5~10千克的体积重量比混合均匀后即得固体微生物修复剂。
3.根据权利要求2所述的一种修复土壤生态系统的微生物修复剂，其特征在于，所述固体吸附物为草炭土和蛭石的混和物，经粉碎、高温消毒后制得。
4.根据权利要求1所述的一种修复土壤生态系统的微生物修复剂，其特征在于，所述主体菌的有效活菌数≥ 3亿/毫升；所述辅助菌的有效活菌数≥1000万/毫升。
5.一种制备权利要求1-4任一所述修复土壤生态系统的微生物修复剂的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)分别用固体培养基复苏巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、酵母菌、乳酸菌和细黄链霉菌，并挑选出单克隆菌落； (2)将挑选出的巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、酵母菌、乳酸菌和细黄链霉菌的单克隆菌落分别接种在一级液体培养基中，获得液体菌种； (3)分别将巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、酵母菌、乳酸菌和细黄链霉菌的液体菌种在二级培养培养基中，放大培养； (4)分别将巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、丁酸梭菌、酵母菌、乳酸菌和细黄链霉菌经放大培养的菌液接种到发酵罐中发酵培养，得到生产用菌液； (5)将生产用菌液按照权利要求1中活菌数比例配比，混合均匀得到液体微生物修复剂； (6)草炭土和蛭石粉碎，经高温灭菌，冷却至室温后，将上述液体微生物修复剂喷洒在其上，充分吸收混合均匀后即得到固体微生物修复菌剂。
6.权利要求1-4任一所述修复土壤生态系统的微生物修复剂在修复土壤中的应用。
【文档编号】C12R1/11GK103627658SQ201310607191
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】高宇 申请人:安徽远大机械制造有限公司