一株具有耐受重金属特性的高效解磷草酸青霉菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株具有高效解磷特性的菌株草酸青霉，经分类命名为草酸青霉（Penicillium?oxalicum），已将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC?No.7699。本发明还公开了上述高效解磷菌株草酸青霉对重金属的耐性。本发明菌株在液体摇瓶培养情况下，对难溶性磷酸盐磷酸三钙、磷酸镁和磷酸铝具有极强的溶解效果，对磷酸三钙和磷酸镁的溶解效果达到100%，对磷酸铝的溶解效果达到95.5%。将该草酸青霉分别接种于含有Pb2+、Zn2+、Cr2+、Mn2+、Cu2+、As5+、Cd2+等重金属的液体培养液中，对上述重金属均具有较强的抗性，特别是对Pb2+、Zn2+、Cr2+、Mn2+的耐受浓度均别达到2000mg/L。因此，本发明能为将来开发抗重金属高效解磷菌菌剂提供优良的菌株资源。
【专利说明】一株具有耐受重金属特性的高效解磷草酸青霉菌
【技术领域】
[0001]本发明属于环境生物【技术领域】，具体涉及一株具有高效解磷及耐受重金属特性的
草酸青霉。
【背景技术】
[0002]磷是植物必需的营养元素之一，我国有74%的耕地土壤缺磷。土壤中95%以上的磷为无效形式，植物很难直接吸收利用。施入的磷肥当季作物利用率为5%~25%，大部分磷与土壤中的Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+结合，形成难溶性磷酸盐。提高磷的利用率一直是农学家关注的问题。很多因素影响土壤磷的利用效率，其中，微生物对土壤磷的转化和有效性影响很大。大量的研究结果证明:土壤中存在大量的微生物，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态，增强植物对土壤中磷元素的摄取。目前，对解磷微生物的研究主要集中在解磷细菌方面，解磷真菌方面的研究相对较少。例如:中国发明专利(申请号:201110121381.5)公开了一株南方红豆杉根际高效解磷嗜松青霉及其应用；中国发明专利(申请号:201210235182.1)公开了一种马尾松根际解磷真菌泡盛曲霉及其应用。
[0003]矿山开采造成矿区大片植被和耕地被破坏，同时还产生大量矿业废物，严重影响土壤质地和结构。矿山开采所产生的大量酸性矿井水和尾砂矿是造成矿区及其周围地区生态系统重金属污染的主要原因之一，成为环境中重金属污染的主要污染源。近年来，国内外关于矿区土地复垦和生态重建的研究十分活跃，其中适生优良先锋植物种类的筛选和培育是一种行之有效的方法。但是矿区复垦地除了存在重金属污染的问题外，复垦地土壤的肥力低，尤其是有效磷含量低的问题，是限制矿区复垦地植被重建的重要因素。
[0004]本专利涉及的菌种是从湖南省湘西州花垣县的铅锌尾矿区分离筛选出的一株高效解磷草酸青霉，而且该菌株对Pb2+、Zn2+、Cr2+、Mn2+等重金属具有很强的抗性。目前关于高效解磷草酸青霉及其耐重金属方面的研究在国内还未见相关报道。因此，从矿区污染地筛选耐受重金属的高效解磷真菌，对调节土壤磷素供需矛盾，改善矿区复垦地土壤肥力，促进当地植被生长具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种能够耐受重金属的高效解磷草酸青霉。
[0006]为了实现上述发明的目的，本发明采用的技术方案如下:
本发明采用的高效解磷、耐受重金属的菌株是由我们实验室从湖南省湘西州花垣县的铅锌矿表层土壤中分离筛选出来的，将其编号为TJ2，分类命名为草酸青霉(penici11iumoxalicum),已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编:100101)，保藏编号CGMCC N0.7699，保藏日期为2013年6月14日。
[0007]该菌株的主要生物学特征:分生孢子梗直立、无色、有分隔、具有帚状枝、且为做三次分枝的帚状形态，帚状枝上小梗丛生于分枝顶端呈花瓶状、分生孢子常链状生长、球形至椭圆形、无色至着色、表面光滑。该菌在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上菌落边缘为白色，孢子形成后浅绿至深绿色。
[0008]将该菌株的18SrDNA ITS序列通过PCR扩增，获得600bp左右长度的扩增产物，扩增产物经测序公司进行序列测定，将所测序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对，结果表明，该菌株与青霉属{Penicillium)同源性都很高,与草酸青霉iP.0xalicum)的相似度为99%以上。结合形态特征、培养特征及18SrDNA ITS序列分析，该菌株确定为草酸青霉 iPeniciIlium oxalicum)。
[0009]上述菌株在溶解难溶性无机磷酸盐中的作用:在液体摇瓶实验中，该菌株对难溶性磷酸盐磷酸三钙(Ca3 (PO4) 2)、磷酸镁(Mg3 (PO4) 2)和磷酸铝(AlPO4)具有极强的溶解效果。其中，对磷酸三钙和磷酸镁的溶解效果达到100%，对磷酸铝的溶解效果达到95.5%。
[0010]上述菌株对重金属耐性方面的作用:本发明菌株除了具有很强的无机盐解磷特性，还对多种重金属具有耐性。将该菌株分别接种于含有Pb2+、Zn2+、Cr2+、Mn2+、CU2+、As5+、Cd2+等重金属的液体培养液中，对上述重金属均具有较强的抗性，特别是对Pb2+、Zn2+、Cr6+、Mn2+的耐受浓度均别达到2000mg/L以上。因此，该菌在重金属污染的矿区土壤的生物修复中具有广阔的应用潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是草酸青霉菌TJ2菌株在摇瓶中培养时解磷能力和pH值随动态变化图。【具体实施方式】
[0012]根据下面实施例，可以使本领域的技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的仅用于说明本发明，但不作为对本发明实施范围的限定。
[0013]实施例1:解磷草酸青霉菌的筛选和鉴定
本实施方式的草酸青霉菌株从湖南省湘西州花垣县的铅锌矿表层土壤中分离筛选出来的。筛选按以下步骤进行:将采集的土壤立即带回实验室，风干、研碎、过筛，取其中10.0g过筛后的土壤放于带有玻璃珠的100ml无菌水中，制成土壤悬液,此悬液浓度为10沁。将此悬液放于恒温振荡器上以150转/min充分震荡30min,取出后稍微静置,从该样品菌悬液中取IOml加入到90ml的无菌水中，制成菌悬液的浓度为10_2，再以此方法进行10倍梯度稀释，直至稀释液的浓度为10_4为止。取10_4浓度的菌悬液0.2ml，放在选择性的改良 Pikovskaya 培养基平板上(培养基组成(g/L): (NH4)2SO4 0.5g，MgSO4 ? 7H20 0.3g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g, FeSO4 0.03g, MnSO4 *H20 0.03g，酵母粉 0.5g，葡萄糖 10.0g，Ca3 (PO4)225g，琼脂15g，pH7.0的蒸馏水1000ml)，置于28°C培养箱中培养5d，挑取解磷范围较大的菌落作进一步筛选及菌株纯化。得到的解磷菌经形态学、培养特征以及ISSrDNA的ITS序列测序分析，鉴定该菌株为草酸青霉，命名为草酸青霉{Penicillium oxali cum),该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC N0.7699。
[0014]实施例2:解磷草酸青霉菌对难溶性磷酸盐的解磷性试验 选择五种难溶性磷酸盐，配成如下培养基
解磷培养基 1:葡萄糖 10.0g, (NH4)2SO4 0.5g，MgSO4 ? 7H20 0.3g，NaCl 0.3g，KCl0.3g, FeSO4 0.03g, MnSO4 *H20 0.03g，酵母粉 0.5g，Ca3 (PO4) 2 10g，蒸馏水 1000ml，pH7.0。[0015]解磷培养基2:用磷酸氢镁(MgHPO4)代替解磷培养基I中的Ca3 (PO4) 2，其它成分和含量不变。
[0016]解磷培养基3:用磷酸锌(Zn3(PO4)2代替解磷培养基I中的Ca3(PO4) 2，其它成分和含量不变。
[0017]解磷培养基4:用磷酸铝(AlPO4)代替解磷培养基I中的Ca3 (PO4) 2，其它成分和含量不变。
[0018]解磷培养基5:用磷酸铁(FePO4)代替解磷培养基I中的Ca3(PO4) 2，其它成分和含量不变。
[0019]将上述菌株接种到PDA平板上，培养5d后，用无菌水配制孢子悬液，通过血球板计数法确定孢子悬液浓度为1.6 X IO7个孢子/mL，按ImL/瓶接种量分别接种到装有50mL解磷培养基1、2、3、4和5的IOOmL三角瓶中，以加入相同体积的解磷培养基不接种为对照(CK),每个处理三瓶重复。置于28°C摇床中，150rpm振荡培养培养,培养一周后，发酵液于40C，10000r/min离心lOmin，用钥锑抗比色法测定发酵液中可溶性磷含量，结果见表1所
[0020]其中，解磷率(％)=(接种处理中可溶性磷含量-对照中可溶性磷含量)/培养基中加入的磷含量X 100。
[0021]表1草酸青霉菌对五种难溶性磷酸盐的溶解能力
【权利要求】
1.一株能够高效溶解无机磷酸盐的青霉菌，其特征在于:该菌株是一株草酸青霉菌{Penicillium oxalicum),已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号 CGMCC N0.7699。
2.权利要求1所述的草酸青霉菌，其特征在于:该菌株分生孢子梗直立、无色、有分隔、具有帚状枝、且为做三次分枝的帚状形态，帚状枝上小梗丛生于分枝顶端呈花瓶状、分生孢子常链状生长、球形至椭圆形、无色至着色、表面光滑；在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上菌落边缘为白色，孢子形成后浅绿至深绿色；菌株的18S rDNA ITS基因序列进行了测序分析，序列已经递交到GenBank数据库。
3.权利要求1所述的草酸青霉菌，其特征在于，能够在重金属存在的情况下，高效溶解难溶性无机 磷。
【文档编号】C12R1/80GK103614302SQ201310607201
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】不公告发明人 申请人:北京林业大学