一株白耙齿菌及其培养方法和应用与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一株白耙齿菌及其培养方法和应用。
背景技术：
：白耙齿菌[irpexlacteus(fr.)fr.]，别名白囊耙齿菌，属于多孔菌目，皱孔菌科(meruliaceae)，耙齿菌属(irpex)，生长于阔叶或针叶树的活立木、枯立木或倒木上，一年生，常平伏反卷，偶尔侧生，可引起木材的白色腐朽。白耙齿菌是我国药用菌的一种，具有治疗尿少、浮肿、腰痛、血压升高等症状的功效，同时具有抗炎活性。并且，因其含有木质素酶、纤维素酶及漆酶等可降解性酶类以及较快的生长速度，白耙齿菌被广泛应用于工业造纸、纸浆改性、造纸污水处理、印染污水处理、饮料行业、服装行业、有机合成等行业，并用于对重金属的污染治理和修复。技术实现要素：本发明的目的是提供一株白耙齿菌及其培养方法和应用。本发明首先提供了白耙齿菌(irpexlacteus)pax-2014-1。白耙齿菌(irpexlacteus)pax-2014-1，已于2016年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为cgmccno.12519。白耙齿菌(irpexlacteus)pax-2014-1cgmccno.12519，简称白耙齿菌pax-2014-1。本发明还保护用于培养白耙齿菌pax-2014-1的培养基，为培养基ⅰ或培养基ⅱ。所述培养基ⅰ包括碳源、氮源、碳酸钙、硫酸二氢钾、硫酸镁和水。所述培养基ⅰ的碳氮比为3-15:1。所述培养基ⅰ的碳氮比具体可为6.67：1、12.3：1或9.23：1。所述培养基ⅱ包括碳源、氮源、生长因子、硫酸二氢钾、硫酸镁和水。所述培养基ⅱ的碳氮比为3-15:1。所述培养基ⅱ的碳氮比具体可为6.67：1、12.3：1或9.23：1。每升所述培养基ⅰ可由如下原料组成：碳源45-60克、氮源20-35克、碳酸钙0.5-0.6克、磷酸二氢钾1.0-2.0克、硫酸镁0.5-1.5克，余量为水。每升所述培养基ⅰ可由如下原料组成：碳源45-60克、蛋白胨15-20克、酵母提取物5-15克、碳酸钙0.5-0.6克、磷酸二氢钾1.0-2.0克、硫酸镁0.5-1.5克，余量为水。每升所述培养基ⅱ可由如下原料组成：碳源45-60克、氮源20-35克、生长因子0.5-0.6克、磷酸二氢钾1.0-2.0克、硫酸镁0.5-1.5克，余量为水。每升所述培养基ⅱ可由如下原料组成：碳源45-60克、蛋白胨15-20克、酵母提取物5-15克、生长因子0.5-0.6克、磷酸二氢钾1.0-2.0克、硫酸镁0.5-1.5克，余量为水。所述碳源具体可为可溶性淀粉和/或葡萄糖。所述氮源具体可为蛋白胨和/或酵母提取物。所述培养基ⅰ具体可为培养基甲、培养基乙或培养基丙。每升所述培养基甲具体可由如下原料组成：可溶性淀粉60.0克、蛋白胨20.0克、酵母提取物15.0克、碳酸钙0.6克、磷酸二氢钾2.0克、硫酸镁1.5克，余量为水。自然ph。每升所述培养基乙具体可由如下原料组成：葡萄糖60.0克、蛋白胨15.0克、酵母提取物5.0克、碳酸钙0.5克、磷酸二氢钾1.0克、硫酸镁0.5克，余量为水。自然ph。每升所述培养基丙具体可由如下原料组成：葡萄糖45.0克、蛋白胨15.0克、酵母提取物5.0克、碳酸钙0.5克、磷酸二氢钾1.0克、硫酸镁0.5克，余量为水。自然ph。本发明还保护一种培养白耙齿菌pax-2014-1的方法，包括如下步骤：采用以上任一所述培养基培养白耙齿菌pax-2014-1。所述方法具体包括如下步骤：(1)将白耙齿菌pax-2014-1单菌落接种于pda培养基平板上，30℃静置培养5天；(2)从完成步骤(1)的平板上用打孔器打取直径为6毫米的菌饼，每12个菌饼接种至1l所述培养基，30℃、150rpm振荡培养72小时。本发明提供的培养基，组成成分明确。采用本发明提供的培养基生产白耙齿菌菌丝体具有工艺简单、不存在重金属污染、菌体生长速度快、菌体产率高、产品质量稳定等优点。本发明还保护一种白耙齿菌pax-2014-1的提取物的制备方法，其特征在于：以白耙齿菌pax-2014-1为原料，依次进行如下步骤：(a1)水提；(a2)醇沉；(a3)收集沉淀。所述(a1)中，水提的条件具体可为：90℃静置提取。所述(a1)中，水提的条件具体可为：90℃静置提取2-6小时。所述(a1)中，白耙齿菌pax-2014-1与水的配比可为：1克白耙齿菌pax-2014-1(湿重)：30-90毫升水。所述(a1)具体包括如下步骤：①取n克白耙齿菌pax-2014-1(湿重)，加入30*n毫升水，90℃静置提取2小时，收集上清液；②取步骤①剩余的菌体，加入30*n毫升水，90℃静置提取2小时，收集上清液；③取步骤②剩余的菌体，加入30*n毫升蒸馏水，90℃静置提取2小时，收集上清液；④将步骤①得到的上清液、步骤②得到的上清液和步骤③得到的上清液合并，然后减压浓缩至三分之一体积，得到浓缩液；n为正数。所述(a2)中，醇沉具体可为乙醇沉淀。所述(a2)中，醇沉的条件具体可为4℃静置。所述(a2)中，醇沉的条件具体可为4℃静置24小时。所述(a2)中，所述浓缩液与无水乙醇的体积配比为1：3。所述(b3)具体包括如下步骤：取1体积份步骤(a1)得到的浓缩液，与3体积份无水乙醇混合，4℃静置24小时。所述(a3)中，通过离心收集沉淀。所述离心的条件具体可为：8000rpm离心30min。所述方法还包括如下步骤：将(a3)得到的沉淀进行冷冻干燥，得到冻干粉。本发明还保护一种白耙齿菌pax-2014-1的提取物的制备方法，依次包括如下步骤：(b1)采用以上任一所述培养基培养白耙齿菌pax-2014-1，然后收集菌体沉淀；(b2)水提；(b3)醇沉；(b4)收集沉淀。所述(b1)具体包括如下步骤：(1)将白耙齿菌pax-2014-1单菌落接种于pda培养基平板上，30℃静置培养5天；(2)从完成步骤(1)的平板上用打孔器打取直径为6毫米的菌饼，每12个菌饼接种至1l所述培养基，30℃、150rpm振荡培养72小时。(3)完成步骤(2)后，取整个培养体系，6000rpm离心20min，收集菌体沉淀。所述(b2)中，水提的条件具体可为：90℃静置提取。所述(b2)中，水提的条件具体可为：90℃静置提取2-6小时。所述(b2)中，所述菌体沉淀与水的配比可为：1克菌体沉淀(湿重)：30-90毫升水。所述(b2)具体包括如下步骤：①取n克所述菌体沉淀，加入30*n毫升水，90℃静置提取2小时，收集上清液；②取步骤①剩余的菌体，加入30*n毫升水，90℃静置提取2小时，收集上清液；③取步骤②剩余的菌体，加入30*n毫升蒸馏水，90℃静置提取2小时，收集上清液；④将步骤①得到的上清液、步骤②得到的上清液和步骤③得到的上清液合并，然后减压浓缩至三分之一体积，得到浓缩液；n为正数。所述(b3)中，醇沉具体可为乙醇沉淀。所述(b3)中，醇沉的条件具体可为4℃静置。所述(b3)中，醇沉的条件具体可为4℃静置24小时。所述(b3)中，所述浓缩液与无水乙醇的体积配比为1：3。所述(b3)具体包括如下步骤：取1体积份步骤(b2)得到的浓缩液，与3体积份无水乙醇混合，4℃静置24小时。所述(b4)中，通过离心收集沉淀。所述离心的条件具体可为：8000rpm离心30min。所述方法还包括如下步骤：将(b4)得到的沉淀进行冷冻干燥，得到冻干粉。以上任一所述方法制备得到的提取物也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种产品，其活性成分为如下(c1)或(c2)：(c1)白耙齿菌pax-2014-1；(c2)以上任一所述提取物。所述产品的功能为如下(d1)和/或(d2)和/或(d3)和/或(d4)和/或(d5)：(d1)治疗和/或预防痛风；(d2)治疗和/或预防高尿酸血症；(d3)治疗和/或预防慢性肾小球肾炎；(d4)治疗和/或预防肾小球肾炎；(d5)治疗和/或预防肾炎。本发明还保护白耙齿菌pax-2014-1或以上任一所述提取物在制备产品中的应用。所述产品的功能为如下(d1)和/或(d2)和/或(d3)和/或(d4)和/或(d5)：(d1)治疗和/或预防痛风；(d2)治疗和/或预防高尿酸血症；(d3)治疗和/或预防慢性肾小球肾炎；(d4)治疗和/或预防肾小球肾炎；(d5)治疗和/或预防肾炎。所述产品为药物或保健品。本发明提供了一株白耙齿菌新菌株并研发优化了用于培养该新菌株的培养基以及制备了该菌株的提取物。白耙齿菌pax-2014-1的提取物对于多种疾病均具有良好的疗效且副作用低，具有重大的应用前景。附图说明图1为菌株pax-2014-1在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上25℃培养5天后的照片。图2为菌株pax-2014-1的菌丝在显微镜下的照片。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。对照培养基：200g土豆切块煮汁，用纱布过滤并收集滤液，在滤液中加入20g葡萄糖，用蒸馏水定容至1000ml。pda培养基：200g土豆切块煮汁，用纱布过滤并收集滤液，在滤液中加入20g葡萄糖和20克琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。益肾康胶囊：长春益肾康生物制药有限公司。对照白耙齿菌，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为cgmccno.1016。对照白耙齿菌记载于申请号为201210461164.5的专利中(该专利的授权公告号为：cn102935095b；授权公告日为：2013-11-27)。实施例1、白耙齿菌pax-2014-1的获得一、菌株的分离2014年，从中国长白山地区采集白耙齿菌的标本，然后通过组织块分离菌株，得到若干纯培养的菌株，将其中一株命名为菌株pax-2014-1。二、菌株的鉴定菌株pax-2014-1的形态特征：菌落呈白色，薄，轻微升起的棉花絮状；在整个菌落表面放射状排列着一些密集的簇状和羽毛状的气生菌丝体，菌丝有隔，透明，直径1.2-4μm，无锁状联合。菌株pax-2014-1在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上25℃培养5天后的照片见图1，长满直径9cm的平板。菌株pax-2014-1的菌丝在显微镜下的照片见图2。菌株pax-2014-1的its序列见序列表的序列1。三、菌株的保藏白耙齿菌(irpexlacteus)pax-2014-1，已于2016年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为cgmccno.12519。白耙齿菌(irpexlacteus)pax-2014-1cgmccno.12519，简称白耙齿菌pax-2014-1。实施例2、白耙齿菌pax-2014-1的培养一、利用碳氮比为6：1的白耙齿菌半合成培养基生产白耙齿菌菌粉培养基甲(自然ph)：取可溶性淀粉60.0克、蛋白胨20.0克、酵母提取物15.0克、碳酸钙0.6克、磷酸二氢钾2.0克、硫酸镁1.5克，用蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至1000毫升。淀粉中的碳含量为40％(质量百分含量)，蛋白胨中的氮含量为9％(质量百分含量)，酵母提取物中的氮含量为12％(质量百分含量)。经计算，培养基甲中碳和氮的质量比为6.67：1。1、将白耙齿菌pax-2014-1单菌落接种于pda培养基平板上，30℃静置培养5天。2、从完成步骤1的平板上用打孔器打取直径为6毫米的菌饼，每12个菌饼接种至1l培养基甲(或对照培养基)，30℃、150rpm振荡培养72小时。3、完成步骤2后，取整个培养体系，6000rpm离心20min，收集菌体沉淀。4、将步骤3得到的菌体沉淀进行冷冻干燥，得到冻干粉。采用培养基甲时，每升培养体系得到冻干粉15.25克(五次重复试验的平均值)。采用对照培养基时，每升培养体系得到冻干粉3.83克(五次重复试验的平均值)。二、利用碳氮比为12：1的白耙齿菌半合成培养基生产白耙齿菌菌粉培养基乙：取葡萄糖60.0克、蛋白胨15.0克、酵母提取物5.0克、碳酸钙0.5克、磷酸二氢钾1.0克、硫酸镁0.5克，用蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至1000毫升。葡萄糖中的碳含量为40％(质量百分含量)，蛋白胨中的氮含量为9％(质量百分含量)，酵母提取物中的氮含量为12％(质量百分含量)。经计算，培养基乙中碳和氮的质量比为12.3：1。1、将白耙齿菌pax-2014-1单菌落接种于pda培养基平板上，30℃静置培养5天。2、从完成步骤1的平板上用打孔器打取直径为6毫米的菌饼，每12个菌饼接种至1l培养基乙(或对照培养基)，30℃、150rpm振荡培养72小时。3、完成步骤2后，取整个培养体系，6000rpm离心20min，收集菌体沉淀。4、将步骤3得到的菌体沉淀进行冷冻干燥，得到冻干粉。采用培养基乙时，每升培养体系得到冻干粉15.36克(五次重复试验的平均值)。采用对照培养基时，每升培养体系得到冻干粉3.83克(五次重复试验的平均值)。三、利用碳氮比为9：1的的白耙齿菌半合成培养基生产白耙齿菌菌粉培养基丙：取葡萄糖45.0克、蛋白胨15.0克、酵母提取物5.0克、碳酸钙0.5克、磷酸二氢钾1.0克、硫酸镁0.5克，用蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至1000毫升。葡萄糖中的碳含量为40％(质量百分含量)，蛋白胨中的氮含量为9％(质量百分含量)，酵母提取物中的氮含量为12％(质量百分含量)。经计算，培养基丙中碳和氮的质量比为9.23：1。1、将白耙齿菌pax-2014-1单菌落接种于pda培养基平板上，30℃静置培养5天。2、从完成步骤1的平板上用打孔器打取直径为6毫米的菌饼，每12个菌饼接种至1l培养基丙(或对照培养基)，30℃、150rpm振荡培养72小时。3、完成步骤2后，取整个培养体系，6000rpm离心20min，收集菌体沉淀。4、将步骤3得到的菌体沉淀进行冷冻干燥，得到冻干粉。采用培养基丙时，每升培养体系得到冻干粉16.27克(五次重复试验的平均值)。采用对照培养基时，每升培养体系得到冻干粉3.83克(五次重复试验的平均值)。实施例3、用白耙齿菌pax-2014-1制备胶囊培养基丙：取葡萄糖45.0克、蛋白胨15.0克、酵母提取物5.0克、碳酸钙0.5克、磷酸二氢钾1.0克、硫酸镁0.5克，用蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至1000毫升。1、将白耙齿菌pax-2014-1单菌落接种于pda培养基平板上，30℃静置培养5天。2、从完成步骤1的平板上用打孔器打取直径为6毫米的菌饼，每12个菌饼接种至1l培养基丙，30℃、150rpm振荡培养72小时。3、完成步骤2后，取整个培养体系，6000rpm离心20min，收集菌体沉淀。4、取步骤3得到的菌体沉淀(湿重＝n克，n为正数)，加入30*n毫升蒸馏水，90℃静置提取2小时，收集上清液。5、取步骤4剩余的菌体，加入30*n毫升蒸馏水，90℃静置提取2小时，收集上清液。6、取步骤5剩余的菌体，加入30*n毫升蒸馏水，90℃静置提取2小时，收集上清液。7、将步骤4得到的上清液、步骤5得到的上清液和步骤6得到的上清液合并，然后减压浓缩至三分之一体积，得到浓缩液。8、取1体积份步骤7得到的浓缩液，与3体积份无水乙醇混合，4℃静置24小时，然后8000rpm离心30min，收集沉淀进行冷冻干燥，得到冻干粉。9、每个胶囊壳装入0.3g步骤8得到的冻干粉，得到pax-2014-1胶囊。用对照白耙齿菌代替白耙齿菌pax-2014-1进行上述步骤，得到对照胶囊。实施例4、白耙齿菌pax-2014-1在治疗痛风和高尿酸血症中的应用高尿酸血症合并痛风的患者24例(男16例，女8例)、未发生高尿酸血症的痛风患者4例(男2例，女2例)，未发生痛风的高尿酸血症患者4例(全部男性)。以上患者均为经三甲医院确诊的知情同意的志愿者。患者中，男性22例，女性10例，年龄33-78岁之间，病程5个月-6年之间。治疗过程中已排除：1)妊娠妇女；2)对本药及其中任何成分过敏者；3)心血管、肝脏、造血系统等存在严重原发性疾病者；4)hiv患者和其它免疫系统严重受损者；5)精神病患者；6)不坚持服药者。患者按如下方案进行治疗：服用实施例3制备的pax-2014-1胶囊，每次3粒，每天3次，连续服用60天。完成治疗后，进行治疗效果评判和副作用评判。治疗效果评判标准如下：痊愈：①发病部位疼痛、红肿等症状完全消失；②血清中的尿酸含量达到健康标准；同时满足以上①和②判断为痊愈；显效：①与治疗前相比，发病部位疼痛、红肿等症状有明显好转；②血清中的尿酸含量没有达到健康标准，但与治疗前相比血清中的尿酸含量降低数值≥20μmol/l；③发病部位疼痛完全消失，与治疗前相比血清中尿酸含量没有升高；满足③或者同时满足①和②判断为显效；有效：①与治疗前相比，发病部位疼痛、红肿等症状有明显好转；②与治疗前相比，血清中的尿酸含量没有显著降低也没有升高；同时满足以上①和②判断为有效；无效：①与治疗前相比，发病部位疼痛、红肿等症状均无明显改善或加重；②与治疗前相比，血清中的尿酸含量没有显著降低或升高；同时满足以上①和②判断为无效；血清中的尿酸含量的健康标准：男性的血清中的尿酸含量为150～440μmol/l；女性的血清中的尿酸含量为95～360μmol/l。副作用评判标准如下：口干和/或胃部不适和/或恶心。治疗前(治疗开始的前一天)，治疗后(治疗结束的第二天)，患者的血清中的尿酸含量、肌酐含量和尿素氮含量的平均值见表1。表1治疗前治疗后尿酸(μmol/l)569,+/-182512,+/-105肌酐(μmol/l)327.6,+/-114.6238.5,+/-79.2尿素氮(mmol/l)9.79,+/-5.817.75,+/-3.8832例患者中：痊愈3例，显效14例，有效11例，无效4例,总有效率87.5％；发病部位疼痛完全消失的17例，总体症状明显改善的28例；出现口干副作用的5例，胃部不适副作用的4例，恶心副作用的0例。以上结果表明，白耙齿菌pax-2014-1提取物能够显著改善高尿酸血症和/或痛风患者的疼痛和红肿症状，降低血清中的尿酸含量、肌酐含量和尿素氮含量，且副作用很低。实施例5、白耙齿菌pax-2014-1在治疗慢性肾小球肾炎中的应用第一组：慢性肾小球肾炎患者129例(男69例，女60例)。第二组：慢性肾小球肾炎患者132例(男64例，女68例)。第三组：慢性肾小球肾炎患者132例(男62例，女70例)。以上患者均为经三甲医院确诊的知情同意的志愿者。治疗过程中已排除：1)妊娠妇女；2)对本药及其中任何成分过敏者；3)心血管、肝脏、造血系统等存在严重原发性疾病者；4)hiv患者和其它免疫系统严重受损者；5)精神病患者；6)不坚持服药者。两组患者分别按如下方案进行治疗：第一组：服用实施例3制备的pax-2014-1胶囊，每次2粒，每天3次，连续服用30天。第二组：服用实施例3制备的对照胶囊，每次2粒，每天3次，连续服用30天。第三组：服用益肾康胶囊，每次2粒，每天3次，连续服用30天。治疗效果评判标准如下：痊愈：①水肿等症状及体征完全消失；②尿蛋白检查持续阴性和/或24小时尿蛋白定量持续小于200mg；③高倍镜下尿红细胞消失；④尿沉渣计数正常；⑤肾功能恢复正常(肾功能恢复正常表现为血清中肌酐含量正常和血清中尿素氮含量正常；男性血清中肌酐含量62～115μmol/l为正常，女性血清中肌酐含量53～97μmol/l为正常，血清中尿素氮含量3.2～7.1mmol/l为正常；同时满足以上①至⑤；显效：①水肿等症状及体征基本消失；②尿蛋白检查持续减少50％以上；③高倍镜下尿红细胞为3个以下；④尿沉渣计数接近正常；⑤肾功能与正常值相差不超过15％；同时满足以上①至⑤；有效：①水肿等症状及体征明显好转；②尿蛋白检查持续减少1个+或24小时尿蛋白定量持续减少25％以上；③高倍镜下尿红细胞为5个以下；④肾功能有改善；同时满足以上①至④；无效：临床表现以及以上检查项目均无明显改善或加重。第一组的129例患者中：痊愈18例，显效45例，有效65例，无效1例,总有效率99.2％；出现口干副作用的2例，胃部不适副作用的1例。第二组的132例患者中，痊愈16例，显效44例，有效66例，无效6例，总有效率95.4％；出现口干副作用的6例，胃部不适副作用的3例，纳差副作用的2例。第三组的132例患者中，痊愈14例，显效40例，有效69例，无效9例，总有效率93.1％；出现口干副作用的32例，胃部不适副作用的40例，纳差副作用20例，恶心副作用12例。序列表<110>郭清子郭尚印<120>一株白耙齿菌及其培养方法和应用<130>gncyx161649<160>1<210>1<211>634<212>dna<213>白耙齿菌（irpexlacteus）<400>1cattatcgagttttgaacgggttgtagctggcctctcacgaggcatgtgcacgcctggct60catccactcttaacctctgtgcactttatgtaagagaaaaaaatggtggaagcttccagg120atctcgcgagaggtcttcggttgaacaagccgtttttctttcttatgttttactacaaac180gcttcagttatagaatgtcaactgtgtataacacatttatatacaactttcagcaacgga240tctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgca300gaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcactccttggtattccgaggagt360atgcctgtttgagtctcatggtattctcaacccctaaatttttgtaatgaaggtttagcg420ggcttggacttggaggttgtgtcggcccttgtcggtcgactcctctgaaatgcattagcg480tgaatcttacggatcgccttcagtgtgataattatctgcgctgtggtgttgaagtattta540tggtgttcatgcttcgaaccgtctccttgccgagacaatcatttgacaatctgagctcaa600atcaggtaggactacccgctgaacttaagcatat634当前第1页12