本发明属于生物制药领域，涉及一种棘白菌素b生产菌高产菌株的筛选方法。
背景技术：
20世纪70年代人类发现了棘白菌素类药物，是一种构巢曲霉的次级代谢产物，主要有三种类型，其中棘白菌素b(echinocandinb)是最为重要的类型。其分子结构中包含一个带有脂类侧链的环状六肽核，该脂类侧链能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性，从而导致细胞壁葡聚糖的排空、渗透不稳定以及真菌细胞的溶解而发挥其抗真菌作用，表现出抗菌谱广、活性强的特点，是治疗免疫抑制患者和免疫正常患者真菌感染的重要选择药物，主要作用于念珠菌属(candidas)和曲霉菌属(aspergillus)。
现在使用的棘白菌素b的生产菌株产量较低，增大了下游药物提取的难度，产品质量不高。因此，高产菌株的获得对棘白菌素b的发酵生产具有非常重要的意义。常规的自然选育周期长、效率低、随机性大以及大量筛选，导致很难获得优良特性菌株。而采用不同的诱变剂处理微生物的细胞群体，然后采用简便高效的筛选方法，从中选出良性突变菌株，成为菌种改良的主要方法。
本方法根据棘白菌素b产生菌产物反馈抑制的特性，在筛选平板中加入适量的棘白菌素b，作为初筛，筛选出消除产物反馈抑制的菌株。另外，由于棘白菌素b为胞内代谢物，采取将诱变菌株的菌丝体浸泡于有机溶剂中将棘白菌素b浸提，再利用其对白色念珠菌的抑菌作用，根据抑菌圈大小，从初筛选出的菌株中再次筛选棘白菌素b高产菌株，达到复筛的目的。最终将筛选出的高产菌株用发酵摇瓶考察其生产能力。该筛选方法简便有效，大大的缩短了筛选周期，提高了效率。
技术实现要素：
本发明通过大量实验研究，目的在于提供一种棘白菌素b生产菌-构巢曲霉菌(aspergillusnidulans)高产菌株的筛选方法。所述筛选方法最终筛选得到了一种棘白菌素b生产菌高产菌株，该菌种已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.8987，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。
所述筛选方法为：通过消除产物反馈抑制对诱变菌株进行初筛，然后根据对白色念珠菌的抑菌圈大小来达到复筛的目的，最后对筛选出的优良菌株用发酵摇瓶考察其生产能力。具体步骤如下：
(1)将适当稀释处理的构巢曲霉菌孢子悬浮液经诱变处理后，涂布于筛选平板上，恒温培养。根据产物反馈原理，如果诱变菌株在含有棘白菌素b的筛选平板上生长良好，说明有可能消除了反馈抑制，可能为高产菌株，将其做好标记，挑取半个菌落浸于有机溶剂中，将菌株胞内的棘白菌素b浸提,而剩余半个菌落做菌种保藏。
(2)从步骤(1)中的浸提液中，取10微升加入小滤纸片。将其置于长好白色念珠菌的平板上,并做好标记。28℃培养24小时后，观察抑菌圈大小，从初筛获得的菌株中再次筛选出抑菌圈大的菌株，达到复筛的目的，并根据标记将对应的步骤(1)中保存的半个菌落进行传代培养。
(3)将步骤(2)中所筛选的菌株经过传代培养后，制备成种子液接种于发酵摇瓶。26℃280rpm培养6天后，检测发酵单位。
上述高产菌株筛选方法，其中步骤(1)中所述诱变方法为紫外线诱变、ntg诱变、离子束诱变。
上述高产菌株筛选方法，其中步骤(1)中，所用平板培养基组份为：葡萄糖2-10g/l、玉米浆干粉3-10g/l、麦芽提取物4-10g/l、k2hpo40.5-5g/l、feso4.7h2o0.005-0.035g/l、znso4.7h2o0.005-0.045g/l、mncl2.4h2o0.005-0.015g/l、琼脂20-25g/l、ph为6-8，加入棘白菌素b0.05-1.5g/l。
上述高产菌株筛选方法，其中步骤(1)中有机溶剂为乙醇、丙酮、甲醇。
上述高产菌株筛选方法，其中步骤(1)中，有机溶剂的量为100-500ul。
上述高产菌株筛选方法，其中步骤(1)中恒温培养箱的控温为26-37℃，时间2-8d。
上述高产菌株筛选方法，其中步骤(1)中浸提时的浸泡时间为0.20-4.0h。
上述高产菌株筛选方法，其中步骤(3)发酵摇瓶培养基组份为葡萄糖2-10g/l、玉米浆干粉3-10g/l、麦芽提取物4-10g/l、k2hpo40.5-5g/l、feso4.7h2o0.005-0.035g/l、znso4.7h2o0.005-0.045g/l、mncl2.4h2o0.005-0.015g/l，ph为6-8。
构巢曲霉菌cgmccno.8987属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、曲霉属的一种真菌，分生孢子柄较短(75～100μm)、弯曲，近顶囊处直径3.5～5.0μm，褐色，表面光滑。分生孢子头短柱形，(40～80)μm×(25～40)μm。顶囊半球形，直径8～10μm，其上有梗基和小梗各一层。小梗上着生圆而粗糙的分生孢子，直径3.0～3.5μm。有性阶段形成球形、暗紫红色闭囊壳，直径135～150μm，外包一层淡黄色、球形、厚壁的壳细胞。子囊孢子双凸镜形、紫红色，上有鸡冠状突起。菌落生长快，圆形、绿色、绒状，当产生大量闭囊壳时呈黄褐色，背面紫红色。
适用于培养构巢曲霉菌cgmccno.8987的培养基是多种多样的，只要能够为该菌株提供生长和繁殖所必需的营养成分的培养基都是可用的。现有文献资料中用于培养其他各种构巢曲霉菌的培养基都适用于本文的构巢曲霉菌cgmccno.8987的培养，比如可以采用葡萄糖、蛋白胨、淀粉、酵母粉、花生粉、燕麦、琼脂等制成的培养基。
本发明所提供的方法操作简便，步骤简单，大大缩短了筛选周期，且通过双重筛选增加了获得高产菌株的几率。本发明筛选所得构巢曲霉菌cgmccno.8987菌株发酵生产棘白菌素b的产量比原始菌株提高720％以上。
具体实施方式
现通过以下实施例来进一步描述本发明的有益效果，实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。
实施例1
(1)将适当稀释处理的构巢曲霉菌孢子悬浮液经紫外线诱变处理后，涂布于筛选平板上。在恒温培养箱中，37℃培养4天，挑选生长良好的菌株900株，做好标记，并分别挑取半个菌落于150微升乙醇中浸泡2小时，剩余的半个菌落保存好。
(2)从步骤(1)中的浸取液中，取10微升加入小滤纸片，将其置于白色念珠菌平板上。28℃培养24小时后，观察抑菌圈大小，挑选出抑菌圈较大的菌株30株，并根据标记将对应标记的步骤(1)中保存的半个菌落进行传代培养。
(3)将步骤(2)中所筛选的菌株经过传代培养后，制备成种子液接种于发酵摇瓶。26℃280rpm培养6天后，检测发酵单位，最终筛选出单位较高的菌株3株，其发酵效价分别为1500mg/l、1480mg/l、1450mg/l，分别较原始菌株提高了750％、740％、725％。
步骤(1)中，所用平板培养基成分和含量为：葡萄糖2g/l、玉米浆干粉3g/l、麦芽提取物4g/l、k2hpo40.5g/l、feso4.7h2o0.05g/l、znso4.7h2o0.005g/l、mncl2.4h2o0.005g/l、琼脂20g/lph为6.0，加入棘白菌素b0.5g/l。
步骤(3)中，发酵摇瓶培养基成分和含量为葡萄糖3g/l、玉米浆干粉4g/l、麦芽提取物5g/l、k2hpo40.6g/l、feso4.7h2o0.005g/l、znso4.7h2o0.005g/l、mncl2.4h2o0.005g/l，ph为6.0。
实施例2
(1)将适当稀释处理的构巢曲霉菌孢子悬浮液经ntg诱变处理后，涂布于筛选平板上。在恒温培养箱中，26℃培养8天，挑选生长良好的菌落750株，做好标记，并分别挑取半个菌落于200微升丙酮中浸泡4小时，剩余的半个菌落保存好。
(2)从步骤(1)中的浸取液中，取10微升加入小滤纸片，将其置于白色念珠菌平板上。28℃培养24小时后，观察抑菌圈大小，挑选出抑菌圈较大的菌株40株，并根据标记将对应标记的步骤(1)中保存的半个菌落进行传代培养。
(3)将步骤(2)中所筛选的菌株经过传代培养后，制备成种子液接种于发酵摇瓶。26℃280rpm培养6天后，检测发酵单位，最终筛选出单位较高的菌株2株，其发酵效价分别为1550mg/l、1490mg/l，分别较原始菌株提高了775％、745％。
步骤(1)中，所用平板培养基成分和含量为：葡萄糖3g/l、玉米浆干粉3.5g/l、麦芽提取物5g/l、k2hpo40.6g/l、feso4.7h2o0.07g/l、znso4.7h2o0.008g/l、mncl2.4h2o0.008g/l、琼脂20g/lph为6.0，加入棘白菌素b0.8g/l。
步骤(3)中，发酵摇瓶培养基成分和含量为葡萄糖3g/l、玉米浆干粉4g/l、麦芽提取物5g/l、k2hpo40.6g/l、feso4.7h2o0.005g/l、znso4.7h2o0.005g/l、mncl2.4h2o0.005g/l、ph为8.0。
实施例3
(1)将适当稀释处理的构巢曲霉菌孢子悬浮液经离子束诱变处理后，涂布于筛选平板上。在恒温培养箱中，35℃培养2天，挑选生长良好的菌落750株，做好标记，并分别挑取半个菌落于300微升甲醇中浸泡0.5小时，剩余的半个菌落保存好。
(2)从步骤(1)中的浸取液中，取10微升加入小滤纸片，将其置于白色念珠菌平板上。28℃培养24小时后，观察抑菌圈大小，挑选出抑菌圈较大的菌株40株，并根据标记将对应标记的步骤(1)中保存的半个菌落进行传代培养。
(3)将步骤(2)中所筛选的菌株经过传代培养后，制备成种子液接种于发酵摇瓶。26℃280rpm培养6天后，检测发酵单位，最终筛选出单位较高的菌株2株，其发酵效价分别为1530mg/l、1570mg/l，分别较原始菌株提高了792％、739％。
步骤(1)中，所用平板培养基成分和含量为：葡萄糖8g/l、玉米浆干粉6g/l、麦芽提取物5g/l、k2hpo42.6g/l、feso4.7h2o0.017g/l、znso4.7h2o0.028g/l、mncl2.4h2o0.008g/l、琼脂20g/lph为7.0，加入棘白菌素b1.2g/l。
步骤(3)中，发酵摇瓶培养基成分和含量为葡萄糖6g/l、玉米浆干粉8g/l、麦芽提取物7g/l、k2hpo43g/l、feso4.7h2o0.025g/l、znso4.7h2o0.025g/l、mncl2.4h2o0.010g/l、ph为7.0。