氨基酸转运基因OsAAP5在水稻选育中的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及氨基酸转运基因OsAAP5在水稻选育中的应用。

背景技术：

植物通过吸收土壤中的氨、硝酸根、氨基酸、可溶性肽等来获得氮素；氮的吸收和转运主要依靠铵根运输蛋白（AMT）、硝酸根运输蛋白（NRT）、氨基酸运输蛋白（AAT）、肽运输蛋白（PTR）等运输蛋白来完成（Williams L, Miller A. Transporters responsible for the uptake and partitioning of nitrogenous solutes. Annu Rev Plant Biol and Plant Mol Biol, 2001, 52: 659-688.）。铵通过植物AMT吸收后再通过谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合酶（GOGAT）合成谷氨酰胺和谷氨酸，后者再进一步形成其它氨基酸（Sonoda Y, Ikeda A, Saiki S, et al. Feedback regulation of the ammonium transporter gene family AMT1 by glutamine in rice. Plant Cell Physiol, 2003, 44: 1396-1402.）。植物可通过高亲和转运系统（HATS）的NRT2和低亲和转运系统（LATS）的NRT1吸收环境中的硝酸盐，由硝酸还原酶（NR）和亚硝酸还原酶（NiR）还原形成铵，再进一步形成氨基酸（Paungfoo-Lonhienne C, Lonhienne T G, Rentsch D, et al. Plants can use protein as a nitrogen source without assistance from other organisms. PNAS, 2008, 105: 4524-4529.）。

在高等植物中，AAT是一类跨膜蛋白，将氨基酸从胞外运至胞内，同时还在氨基酸远距离运输、病原反应和非生物胁迫等方面发挥着重要作用（Tegeder M. Transporters for amino acids in plant cells: some functions and many unknowns. Curr Opin Plant Biol, 2012, 15: 1-7.）。AAT基因被分为两个超家族：APC（氨基酸、多胺和胆碱转运）超家族和AAAP（氨基酸/生长素透性酶）超家族。APC超家族分为三个亚家族：CATs（阳离子氨基酸转运蛋白）家族、ACTs（氨基酸/胆碱转运蛋白）家族和PHSs（多胺、H+协同转运蛋白）家族。AAAP超家族分为六个亚家族：AAPs（氨基酸透性酶）家族、LHTs（赖氨酸和组氨酸转运蛋白）家族、ProTs（脯氨酸转运蛋白）家族、GATs（γ-氨基酸丁酸，GABA）家族、AUXs（生长素转运蛋白）家族和ANTs（芳香族和中性氨基酸转运蛋白）家族（Fischer WN, Andre B, Rentsch D, et al. Amino acid transport in plants. Trends Plant Sci, 1998, 3: 188-195.）。

水稻基因组中共找到85个AAT家族成员（Zhao H, Ma H, Yu L, et al. Genome-wide survey and expression analysis of amino acid transporter gene family in rice (Oryza sativa L.). PLoS ONE, 2012, 7: e49210.）。研究发现OsAAT5、OsAAT7、OsAAT24、OsAAT49和OsAAT60的T-DNA插入突变体的稻米产量及植物体干重均下降，证明AAT对水稻的氮素积累及碳氮分配有着重要作用（Lu Y, Song Z, Lu K, et al. Molecular characterization, expression and functional analysis of the amino acid transporter gene family (OsAATs) in rice. Acta physiol Plant, 2012, 34: 1943-1962.）。研究发现超量表达OsAAP6会增加水稻籽粒中储藏性蛋白和氨基酸含量，从而改善稻米营养和风味（Peng B, Kong H, Li Y, et al. OsAAP6 functions as an important regulator of grain protein content and nutritional quality in rice. Nat Commun, 2014, 5: doi:10.1038.）。氨基酸转运蛋白对水稻等各种植物体的氨基酸吸收、转运和储藏具有重要的作用。目前关于水稻AAP家族成员研究的报道很少，水稻氨基酸转运家族OsAAP5基因的蛋白对水稻的生长发育目前未有任何研究。本发明发现OsAAP5基因对水稻生物量影响有极其重要的作用，可应用于植物株型改良。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供氨基酸转运基因OsAAP5在水稻选育中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以水稻的氨基酸转运基因OsAAP5为对象，从水稻中花11中克隆了OsAAP5的cDNA序列。通过RNAi技术构建OsAAP5基因干扰表达载体，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将干扰表达载体导入正常粳稻品种中花11中，得到OsAAP5基因表达量下降的干扰植株，干扰植株的根长、根数、株高和鲜重等生物量指标与对照野生型中花11相比显著提高。结果表明，OsAAP5基因在阐述氨基酸运输影响植物生长及发育过程方面具有重要的应用价值。

基于本发明发现的OsAAP5基因的功能，其可用于水稻选育中。所述的水稻选育为提高水稻根长、根数、株高和鲜重，从而能提高水稻生物量。具体可通过RNAi技术降低OsAAP5基因的表达或用CRISPR等基因编辑技术敲除OsAAP5基因，使水稻根长、根数、株高和鲜重增加，达到提高水稻生物量的目的。所述的OsAAP5基因编码的OsAAP5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的OsAAP5基因的cDNA序列优选如SEQ ID NO.2所示。

应该理解为，在不影响OsAAP5蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本领域技术人员可对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。因此，OsAAP5蛋白还包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的优点和效果：

（1）本发明克隆的OsAAP5基因干扰表达后使水稻根长、根数、株高和鲜重增加，说明OsAAP5基因对提高水稻生物量较明显，因此，通过基因工程技术降低OsAAP5基因的表达能够提高植物生物量。这不仅有助于通过正常施氮条件下培育生长发育较好的水稻，还可以通过结合基因编辑技术和分子育种进行植物的品种改良。

（2）OsAAP5基因的成功克隆，进一步证实了氨基酸转运家族在氮吸收过程中的重要作用，对阐明氨基酸转运家族的生物学功能有重要的意义，另外对进一步了解植物氮代谢途径，提高氮吸收效率有极大的推动作用。

（3）尽管目前已克隆到了一些促进植物生长发育的基因，但对营养是如何通过关键基因影响植物生长发育的分子机制仍不清楚。而本发明克隆的OsAAP5基因能够提高水稻的生物量，对确定植物生长发育的关键因素有极大的推动作用。

附图说明

图1是对照中花11和OsAAP5基因干扰植株3个株系的整株表型图。

图2是对照中花11和OsAAP5基因干扰植株3个株系OsAAP5基因表达量的统计柱状图，数据采用SPSS软件进行变量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别星号（*）表示与对照相比具有差异显著。

图3是对照中花11和OsAAP5基因干扰植株3个株系根长的统计柱状图，数据采用SPSS软件进行变量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别星号（*）表示与对照相比具有差异显著。

图4是对照中花11和OsAAP5基因干扰植株3个株系根数的统计柱状图，数据采用SPSS软件进行变量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别星号（*）表示与对照相比具有差异显著。

图5是对照中花11和OsAAP5基因干扰植株3个株系株高的统计柱状图，数据采用SPSS软件进行变量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别星号（*）表示与对照相比具有差异显著。

图6是对照中花11和OsAAP5基因干扰植株3个株系鲜重的统计柱状图，数据采用SPSS软件进行变量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上进行差异显著性分析，不同组别星号（*）表示与对照相比具有差异显著。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术（参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约）完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1 OsAAP5基因干扰植株的构建

提取水稻中花11的RNA，并将其反转录成cDNA，利用引物对：

F1：5'-GGTACCGCGGAGAACAAGACGATGAA-3'（KpnI），

R1：5'-GGATCCATGGGCTGGCAGAACACC-3'（BamH I）；

F2：5'-ACTAGTGCGGAGAACAAGACGATGAA-3'（SpeI），

R2：5'-GAGCTCATGGGCTGGCAGAACACC-3'（Sac I）；

各自PCR扩增出OsAAP5基因的cDNA片段，通过上述相应的限制性内切酶酶切后连入pTCK303载体，构建出OsAAP5基因的干扰表达载体OsAAP5-pTCK303。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将干扰表达载体导入正常粳稻品种中花11中。

将得到的所有转基因小苗移栽于带泥土的筐中，定期浇水，施肥，待小苗长高约10cm时，将50株水稻转基因小苗浸泡于蒸馏水制备的含浓度为50mg/L的500mL潮霉素溶液中48小时，之后叶子为绿色并舒张、生长状态良好的植株为阳性转基因植株；而叶子枯黄并卷曲的植株为阴性植株，随即死亡。阳性植株单株种植并收种，直至T2代鉴定出在上述潮霉素溶液中无任何叶子枯黄并卷曲的为纯合的转基因植株，即得到OsAAP5基因的干扰植株。

OsAAP5基因干扰植株的根长、根数、株高和鲜重均显著高于对照中花11植株，如图1、图3-6中所示，可以表明OsAAP5基因降低表达后可以促进水稻生长发育，提高生物量。

取OsAAP5基因干扰植株叶片，提取RNA并将其反转录成cDNA，通过实时荧光定量PCR检测OsAAP5基因在干扰植株的表达量，结果显示（图2）干扰植株中OsAAP5基因的表达量比对照中花11降低。实时荧光定量PCR所用引物对：

F3：5'-GCCACTGACTGTTTACTTCCC-3'，

R3：5'-ACAGAGCCAATGCCCACT-3'。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉生物工程学院

<120> 氨基酸转运基因OsAAP5在水稻选育中的应用

<130> 1

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 465

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 1

Met Asn Lys Asn Ala Ala Pro Glu Asp Val Glu Ser Gly Glu His Glu

1 5 10 15

Arg Thr Gly Thr Val Trp Thr Ala Thr Ala His Ile Val Thr Ala Val

20 25 30

Ile Gly Ser Gly Val Leu Ala Leu Ala Trp Ser Val Ala Gln Leu Gly

35 40 45

Trp Val Ala Gly Pro Leu Ala Leu Ala Gly Phe Ala Cys Val Thr Tyr

50 55 60

Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Ala Asn Ala Tyr Arg Ala Pro His Pro Val

65 70 75 80

Thr Gly Thr Arg Asn Arg Thr Tyr Met Asp Ala Val Arg Ser Tyr Leu

85 90 95

Ser Pro Arg Glu Val Phe Met Cys Gly Ile Ala Gln Tyr Val Asn Leu

100 105 110

Trp Gly Thr Met Val Gly Tyr Thr Ile Thr Ala Thr Ile Ser Met Val

115 120 125

Ala Ile Arg Arg Ser Asp Cys Ile His Arg Asn Gly Ala Gly Ala Ala

130 135 140

Ala Arg Cys Asp Asn Thr Ser Ala Thr Val Leu Met Leu Ala Phe Ser

145 150 155 160

Ile Val Gln Val Val Leu Ser Gln Phe Pro Gly Leu Glu His Ile Thr

165 170 175

Trp Leu Ser Val Val Ala Ala Val Met Ser Phe Ala Tyr Ser Phe Ile

180 185 190

Gly Leu Gly Leu Ser Val Ala Glu Trp Val Ser His Gly Gly His Leu

195 200 205

Ser Gly Arg Ile Gln Gly Ala Thr Ala Ala Ser Ser Ser Lys Lys Leu

210 215 220

Trp Asn Val Leu Leu Ala Leu Gly Asn Ile Ala Phe Ala Tyr Thr Phe

225 230 235 240

Ala Glu Val Leu Ile Glu Ile Gln Asp Thr Leu Lys Pro Ser Pro Pro

245 250 255

Glu Asn Lys Thr Met Lys Lys Ala Ala Met Tyr Gly Ile Gly Ala Thr

260 265 270

Thr Ile Phe Tyr Ile Ser Val Gly Cys Ala Gly Tyr Ala Ala Phe Gly

275 280 285

Ser Asp Ala Pro Gly Asn Ile Leu Thr Ala Ser Gly Met Gly Pro Phe

290 295 300

Trp Leu Val Asp Ile Ala Asn Met Cys Leu Ile Leu His Leu Ile Gly

305 310 315 320

Ala Tyr Gln Val Tyr Ala Gln Pro Ile Phe Ala Thr Met Glu Arg Trp

325 330 335

Ile Ser Ser Arg Trp Pro Glu Ala Lys Phe Ile Asn Ser Glu Tyr Thr

340 345 350

Val Asn Val Pro Leu Ile Gln Arg Gly Ser Val Thr Val Ala Pro Tyr

355 360 365

Lys Leu Val Leu Arg Thr Val Val Val Ile Ala Thr Thr Val Val Ala

370 375 380

Met Met Ile Pro Phe Phe Asn Ala Val Leu Gly Leu Leu Gly Ala Phe

385 390 395 400

Ser Phe Trp Pro Leu Thr Val Tyr Phe Pro Ile Ser Met His Ile Ala

405 410 415

Gln Glu Lys Ile Thr Arg Gly Gly Arg Trp Tyr Leu Leu Gln Gly Leu

420 425 430

Ser Met Val Cys Leu Met Ile Ser Val Ala Val Gly Ile Gly Ser Val

435 440 445

Thr Asp Ile Val Asp Ser Leu Lys Val Ala Thr Pro Phe Lys Thr Val

450 455 460

Ser

465

<210> 2

<211> 1398

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atgaacaaga acgccgcacc ggaagacgtc gagagcggcg agcacgagcg gacagggacg 60

gtatggacgg cgacggcgca cattgttacg gcggtgatcg gctccggcgt gctggcgctg 120

gcgtggagcg tggcgcagct gggttgggtg gccgggccgc tcgccctcgc cggcttcgcc 180

tgcgtcacct actacacctc cactctgctc gccaacgcct accgcgcgcc gcaccccgtc 240

accggcacca ggaaccgcac atacatggac gccgtcagat catacctcag tcctagagag 300

gtgttcatgt gcggaatcgc gcagtacgtc aacctgtggg gcaccatggt cggctacaca 360

atcaccgcaa ccataagcat ggtcgcgatc aggaggtcgg attgcatcca tcggaacggc 420

gccggcgccg ccgcgcggtg cgacaacacg tcggcgacgg tgctcatgct ggcgttcagc 480

atcgtgcagg tggtgctgtc ccagttcccg ggcctggagc acatcacctg gctgtccgtc 540

gtcgccgccg tcatgtcgtt cgcctactcc ttcatcggcc tcggcctgtc cgtggcggag 600

tgggtgtcgc acggcggcca cctcagcggc aggatccagg gcgccaccgc ggcgtcctcc 660

agcaagaagc tctggaacgt actgctcgca ctggggaaca tcgccttcgc ctacaccttt 720

gcagaagtgc taattgagat ccaggacaca ctgaaaccgt caccaccgga gaacaagacc 780

atgaagaagg cagcgatgta cgggattgga gccaccacca tcttctacat ctccgttggc 840

tgcgccgggt acgccgcgtt cggttcagat gctccgggca acatcctgac ggcgtccggt 900

atggggccct tctggctcgt cgacattgcc aacatgtgcc tcatcctcca tctcatcgga 960

gcatatcagg tttatgcaca gcccatattt gcgacaatgg agagatggat ctcctcccgg 1020

tggccggagg ccaagttcat caacagcgag tacaccgtaa acgtgccgct gatccagcga 1080

ggatcggtga ccgtggcgcc gtacaagctc gtcctccgga ccgtcgtagt catcgcgacg 1140

acggtggtgg cgatgatgat accgttcttc aacgcggtgc tggggctcct cggcgccttc 1200

agcttctggc cactgactgt ttacttcccc atcagcatgc acattgcgca ggagaagatc 1260

accaggggag ggaggtggta tctcctgcaa ggcctgagca tggtgtgctt gatgatctcg 1320

gtggcagtgg gcattggctc tgtcactgac attgttgata gcctgaaggt tgcaacccct 1380

ttcaaaactg tcagctaa 1398

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F1

<400> 3

ggtaccgcgg agaacaagac gatgaa 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R1

<400> 4

ggatccatgg gctggcagaa cacc 24

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F2

<400> 5

actagtgcgg agaacaagac gatgaa 26

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R2

<400> 6

gagctcatgg gctggcagaa cacc 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F3

<400> 7

gccactgact gtttacttcc c 21

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R3

<400> 8

acagagccaa tgcccact 18