出芽短梗霉alb1基因敲除突变株及其应用的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及出芽短梗霉alb1基因敲除突变株及其应用。
背景技术：
：出芽短梗霉(Aureobacidiumpullulans)是一类类酵母真菌，具有酵母状和真菌菌丝体两种形态，因其产生大量黑色素，又被称为黑酵母。出芽短梗霉发酵能产生胞外多糖、酶、抗菌素、单细胞蛋白等多种产物，尤其是所产生的普鲁兰多糖具有极佳的成膜性、阻氧性、可塑性、稳定性、粘结性和易自然降解等许多独特的理学和生物学特性，无毒无害，对人体无任何副作用，可广泛地应用于医药、食品、化妆品、烟草、采油等众多领域，是一种有极大开发价值和前景的多功能新型生物制品。由于出芽短梗霉发酵过程中合成大量黑色素，一半以上的黑色素会分泌到发酵液中，与胞外多糖紧密结合，给多糖的纯化和精制带来极大困难，不但降低多糖收率，而且严重影响产品品质。因此，获得不产黑色素的出芽短梗霉菌株是普鲁兰多糖工业化生产的必然需求。构建出芽短梗霉无色素菌株的方法有物理诱变、化学诱变、基因工程构建等。诱变的方法具有简单、快捷、高效的特点，但诱变是一个随机的过程，缺乏方向性，而且诱变菌株传代稳定性差，在发酵过程中极易产生回复突变。基因工程构建菌株具有可操控的方向性，而且基因敲除获得的菌株性状非常稳定，基本不会发生回复突变，在工业微生物改造中得到了大量应用。目前，国内外研究机构普遍采取诱变的方法进行菌株构建，但基因工程构建出芽短梗霉无色素菌株尚未见报道。出芽短梗霉黑色素属于二羟萘(DHN)黑色素，但出芽短梗霉黑色素体内合成途径及相关基因尚未有报道。因此，如何通过基因工程的方法构建出芽短梗霉无色素菌株是目前的技术难点所在。出芽短梗霉无色素菌株的构建研究对于出芽短梗霉的工业化应用具有重要的意义。技术实现要素：针对上述现有技术，本发明的一个目的是提供一株出芽短梗霉alb1基因敲除突变株。本发明提供的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，是将出芽短梗霉菌株中的alb1基因的全部或部分编码基因敲除，替换为潮霉素B抗性基因盒。优选的，是将alb1基因从第1位至1911位之间的编码基因敲除，替换为潮霉素B抗性基因盒。优选的，所述出芽短梗霉菌株为菌株As3.3984，购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号为3.3984。上述As3.3984菌株中的alb1基因的全部编码基因序列如序列表中SEQIDNO.1所示。所述潮霉素B抗性基因盒包含：出芽短梗霉转录延长因子启动子PTEF和潮霉素B抗性基因HygR。所述出芽短梗霉转录延长因子启动子PTEF的序列如序列表中SEQIDNO.2所示；所述潮霉素B抗性基因序列hygR序列如序列表中SEQIDNO.3所示。所述潮霉素B抗性基因HygR来源于大肠杆菌，将启动子替换为出芽短梗酶来源的高效启动子PTEF，目的是使该基因能在出芽短梗酶中正常表达。本发明的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，命名为出芽短梗霉(Aureobacidiumpullulans)Mut，已于2016年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为CGMCCNO.12509。为方便说明，在本发明的后续表述中将“出芽短梗霉(Aureobacidiumpullulans)Mut”记为“As3.3984Δalb1”。本发明的另一目的是提供一种构建上述出芽短梗霉alb1基因敲除突变株的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：(1)合成含alb1左同源臂-潮霉素B抗性基因盒-alb1右同源臂的重组片段，重组片段的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；(2)将步骤(1)的重组片段连接到pUC18质粒上的EcoRI位点，得到alb1基因敲除质粒；(3)将alb1基因敲除质粒转化到出芽短梗霉感受态细胞中，通过潮霉素B抗性筛选得到抗性菌株；对抗性菌株进行鉴定，筛选得到敲除alb1基因的突变株。步骤(1)中，所述重组片段采用全基因合成的方法进行合成。步骤(3)中，利用电转化的方法将alb1基因敲除质粒转化到出芽短梗霉感受态细胞中。步骤(3)中，敲除alb1基因的突变株的筛选方法为：根据SEQIDNO.4序列合成可以扩增潮霉素B抗性基因的引物hyg-1和hyg-2，如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示；根据出芽短梗霉As3.3984基因组中alb1左同源臂左侧序列设计引物out-1，如SEQIDNO.7所示，根据alb1右同源臂右侧序列的反向互补序列设计引物out-2，如SEQIDNO.8所示。用hyg-1/hyg-2和out1-1/out-2两对引物通过PCR的方法对抗性菌株进行鉴定。上述出芽短梗霉alb1基因敲除突变株在制备微生物多糖中的应用也是本发明保护的范围。本发明的第三个目的是提供一种制备微生物多糖的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：在多糖发酵培养基中发酵培养上述的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，发酵液离心，收集上清液，向上清液中加入工业乙醇沉淀多糖，离心，收集沉淀，干燥，纯化，即得微生物多糖。所述多糖发酵培养基的组成为：蔗糖100.0g/L，酵母膏2.0g/L，NaCl1.0g/L，MgSO4.7H2O0.2g/L，K2HPO45.0g/L，(NH4)2SO40.6g/L，pH6.5，115℃灭菌30分钟。发酵培养的条件为：28℃震荡培养72小时。本发明的有益效果：(1)本发明首次利用基因敲除技术对出芽短梗霉的alb1基因编码区进行了部分敲除，经基因敲除后，细胞不能合成黑色素。传统的出芽短梗霉发酵过程中黑色素会分泌到发酵液中并与胞外多糖紧密结合，给多糖的纯化和精制带来困难，采用本发明的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株进行多糖的生产，发酵过程中无黑色素的产生，能明显提高多糖的纯化收率和产品品质。经试验证明，采用本发明的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株进行多糖的生产，与原始菌相比，多糖的纯化收率和纯化后多糖产量能分别提高18.0％和21.4％以上。(2)本发明构建的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，为出芽短梗霉的工业化应用打下了良好的基础。附图说明图1：本发明所述出芽短梗霉alb1基因敲除突变株PCR鉴定电泳图；其中，M.DNAladder；1.以As3.3984基因组为模板，以hyg-1/hyg-2为引物对的PCR产物；2.以As3.3984Δalb1基因组为模板，以hyg-1/hyg-2为引物对的PCR产物；3.以As3.3984基因组为模板，以out-1/out-2为引物对的PCR产物；4.以As3.3984Δalb1基因组为模板，以out-1/out-2为引物对的PCR产物；图2：本发明所述出芽短梗霉原始菌As3.3984和突变株As3.3984Δalb1发酵液及发酵生产的微生物多糖。图中：A.As3.3984发酵液；B.As3.3984Δalb1发酵液；C.As3.3984发酵生产的多糖；D.As3.3984Δalb1发酵生产的多糖。具体实施方式下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法。实施例1：出芽短梗霉alb1基因敲除突变株的构建(1)基因敲除片段合成采用全基因合成方法合成含alb1左同源臂-潮霉素B抗性基因盒-alb1右同源臂的重组片段，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，该重组片段连接到pUC18质粒上的EcoRI位点，构建得到alb1基因敲除质粒。上述重组片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。(2)出芽短梗霉As3.3984电转化感受态制备挑取As3.3984(购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号为3.3984)单菌落接种至3mLYPD液体培养基，28℃震荡培养48小时；转接100μL培养物至50mLYPD液体培养基，28℃培养至OD600为1.0～1.2左右；4℃离心收集菌体，用1mol/L山梨醇溶液细菌2次，最后用3mL1mol/L山梨醇重悬菌体，分装100μL/管，保存于-80℃备用。上述YPD培养液成分：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L，自然pH，115℃灭菌30分钟。其中葡萄糖单独配制灭菌，115℃灭菌30分钟，取出后与其他成分混合。(3)alb1基因敲除质粒电转化取上述步骤(1)中的alb1基因敲除质粒0.1～1μg与上述步骤(2)中制备的As3.3984感受态细胞100μL混合，加入电转杯后冰浴10分钟，在1.0～2.5kV电压、3～5ms脉冲时间条件下电击1～10次。加入1mL含1mol/L山梨醇的YPD液体培养基，28℃，100rpm震荡培养3～4小时后涂布于含有400μg/mL潮霉素B的YPD平板上。28℃培养72小时，挑取单菌落进行鉴定。(4)突变株筛选和验证根据SEQIDNO.4序列设计可以扩增潮霉素B抗性基因的引物hyg-1和hyg-2。引物序列如下：hyg-1:5’-ATGAAAAAGCCTGAACTCAC-3’(SEQIDNO.5)；hyg-2:5’-CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3’(SEQIDNO.6)；根据出芽短梗霉As3.3984基因组中alb1左同源臂左侧序列设计引物out-1，根据alb1右同源臂右侧序列的反向互补序列设计引物out-2，引物序列如下：out-1:5’-AAGGTGGTCATCGTAGCCTC-3’(SEQIDNO.7)；out-2:5’-TGGCAGAGATGACACCAGCA-3’(SEQIDNO.8)；用真菌基因组提取试剂盒提取原始菌As3.3984和步骤(3)中得到的潮霉素B抗性菌落的基因组，提取步骤参照OMEGA公司的真菌基因组提取试剂盒说明书。以上述基因组为模板，分别用hyg-1/hyg-2和out-1/out-2两对引物进行PCR扩增。若突变株发生同源重组双交换，潮霉素B抗性基因盒HygR将替换基因组中alb1基因第1位到第1911位的编码序列。相应的，用hyg-1/hyg-2引物将能够扩增到1026bp的片段，而原始菌结果为阴性。用out-1/out-2引物将能够扩增到2450bp的片段，而原始菌得到的片段为2784bp。筛选PCR产物大小与理论值相符的突变株，经DNA测序验证后，将该菌株命名为As3.3984Δalb1，DNA电泳结果如图1所示。该菌株命名为As3.3984Δalb1，于2016年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为CGMCCNO.12509。实施例2：微生物多糖发酵和纯化实验1.微生物多糖的发酵和纯化：(1)菌株发酵：分别将出芽短梗霉原始菌As3.3984和实施例1中获得的出芽短梗霉突变株As3.3984Δalb1接种于多糖发酵培养基中，28℃震荡培养72小时。上述多糖发酵培养基成分：蔗糖100.0g/L，酵母膏2.0g/L，NaCl1.0g/L，MgSO4.7H2O0.2g/L，K2HPO45.0g/L，(NH4)2SO40.6g/L，pH6.5，115℃灭菌30分钟。(2)沉淀粗多糖：发酵液8000rpm离心10分钟收集上清液；上清液中加入3倍体积工业乙醇沉淀多糖，3000rpm离心5分钟收集沉淀，50℃烘干获得粗多糖。(3)多糖纯化：将粗多糖溶于水，使浓度为5％～10％，粗多糖溶液中加入0.5％～2％活性炭粉末，混匀，50℃保温0.5小时；抽滤除掉活性炭颗粒，收集滤液；滤液中加入3倍体积工业乙醇沉淀多糖，3000rpm离心5分钟收集沉淀，50℃烘干获得多糖。2.结果分析：如图2所示，出芽短梗霉原始菌As3.3984在发酵过程中产生大量黑色素，发酵液呈黑色；而突变株As3.3984Δalb1由于敲除了黑色素合成中的关键酶基因alb1，在发酵过程中不产生黑色素，发酵液呈黄色。对出芽短梗霉原始菌As3.3984和突变株As3.3984Δalb1进行发酵液颜色、多糖颜色、粗多糖产量、多糖产量、多糖收率等比较，结果见表1。由表1可以看出，突变株和原始菌发酵液多糖含量相近，但突变株多糖在纯化过程中的收率和纯化后多糖产量明显高于原始菌，多糖的收率和产量分别提高了18.0％和21.4％。表1出芽短梗霉原始菌和突变株在多糖生产中的比较菌株原始菌As3.3984突变株As3.3984Δalb1发酵液颜色黑色黄色多糖颜色棕黑色白色发酵液多糖含量(g/L)32.0431.56多糖产量(g/L)24.8030.11收率(％)77.495.4以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术的技术人员在本发明批露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING<110>山东省药学科学院;山东福瑞达医药集团公司<120>出芽短梗霉alb1基因敲除突变株及其应用<130>2016<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>6489<212>DNA<213>AureobasidiumpullulansAs3.3984<400>1atgtctaacgttcttcttttcggcgaccagaccgccgagcagtaccctctgctccgcaag60gtggtcctgagaactaagaatgctctcgttctcaacttcctggagcgcaccgtcgtcgct120ctgcgaggagaaattgcccaactctctcgccctcagcgcgatgccattccggatttcatg180accctcaacaacttggtcgatctctactacgagaagggattgaagcttcctcaccttgag240agtgccctggtcactatcgcccagcttggccactacatcggatacttctccgagaagact300aacgagcttcctcctgctgccaacactcgcattcttgctctctgcactggatcactcgcc360gctgccgctgtcgcttccgccagaactcttgatgagctcgtcactcttggtgtcgagacc420gtccgcatcgccttccgcactggtgtccgcgtcaatgaagccagaactgctttgggccag480gacctcatgtccagggagagctggtctactattgtcactggcattaacgagcagtccgcc540aaggaggctctcaacgctttccacgagtctgctggcattcccactaccagccacgcttac600atcagcgctgttagcaccatggccatcactatcagtggtcctcccaccatcactaagcgc660ttcttcgaggagtctgaggctgttcgcaagaacaaccgtgttaagatccccgtttacgct720ccttaccacgccgagcacctctacagcagtgccgatatcgagaccgtcattggcgaggag780tctgctaagctcctccaggcttaccagcctcgttcgttggtccactccggctcatctggc840atgtgccacattgccgagaacaccttcgagctgttcaagttgtccctgaacgacatgctc900agatcccctgttggctggaacaacctcctcgaggagagtgtttcgcagatcaccgccaac960accaacgctcctgctaaggtcttctgcattggtgtcagcaacgtatccaacagcctcgtc1020tcggccatcaaagctggtggccaggcctcggtctccctcgttgaccactctgcctgggag1080tctgccgtcactgatgccagccacggtcgcacccagaacgacaagattgccatcgttggt1140atgtctggtcgtttccccagcgctgccagcaccgaggctctttgggaacttctcgagaag1200ggtctcgatgtccaccgcaagattccctctgaccgtttcgatgccgacgctcactgcgac1260ccctctggcaagggcaagaacaagtcgcacactccttacggttgctttatcgacgagcct1320ggtcttttcgaccctcgcttcttcaacatgtctcctcgtgaggctgcacagactgatcct1380atgggtcgtctggctctcgtcaccgcttacgaggctcttgagcaatctggttacgtcccc1440aaccgtactccctccaccaagcttcaccgcatcggtaccttctacggtcagacctctgac1500gattggcgtgagatcaacgcttccgagaatgttgacacctacttcatcactggtggtgtg1560cgtgctttcgcacctggtcgcatcaactactacttcaagttcagtggtccttcgttctcg1620atcgatactgcttgttcgtcatctttggctgctattcagcttgcctgcacttcgctgtgg1680gccggtgactgcgacactgcctgtgctggtggtctgaacgtccttaccaaccctgacatt1740ttctctggtctttccaagggtcaattcttgtccaagacaggttcttgcaagacttacgac1800aacgctgccgatggttactgccgtggtgatggttgtggtaccgttgtcctcaagagatac1860gaggatgcgcttgccgacaaggacaacatcctcggatgcattcttggcgctgctaccaac1920cactctgctgaggctgtttctattactcaccctcacgctggcgctcaggagttcctttac1980aagaaggtcctcgccaacgctggtgtcgatgcccatgagattagctacgtcgagatgcac2040ggtactggtacccaggctggtgatggtattgagatgacctcagtcaccaacgtcttcgct2100ccccgtcaccgccagcgcaagcctgaggagaagctccaccttggtgccatcaaggccaac2160atcggccacggtgaagccgcttctggtatcaactccctctgcaaggtcttgatgatgatg2220aagaagaacgccattcctgccaacgttggtatcaagggcgagatcaacaagactttcccc2280aaggacttgaaggaccgcaatgtccacattcctcagcagcagatcgacttcccccgcaac2340ggtgctgagaagcgcaagatcttcctcaacaacttctccgctgctggtggtaacaccgcc2400atcctcctcgaggatggtcctcttcgtgaggctcctaaggctgttgaccctagaggcact2460cttcccgtcactgtaactgcccgttcgatcgctgccttgaagaacaacattcagcgtctg2520cagggatacctccgcgagaaccccgagaccactcttcccagcttgtcctacacttcgact2580gcccgccgcatccagcacaactaccgcatcgccttccccattgctgatattgccaaggtc2640agcgatgctctgcaggcccaaactaaggacacctacagcccagtccccatggtttctacc2700aagaccgccttctgcttcaccggacagggctcacagtacactgctcttggtcagaagctc2760taccaagacctcaagtctttccgtgacgacatcaaccagctcgacaacatggccaccatt2820cagggccttccttcgttcattgagctgcttgacggcactgatgtcgctactctttcccct2880gtcaaggttcagctgggtatggcttgtattcaggttgctctcgctcgcatgtgggcttca2940tggggtatcactcctaccgctgtcattggccacaacttgggcgagtacgctgctctccac3000gttgctggtgtcatctctgccagcgacatgatcaccctcgttggtcgtcgtgctgagctc3060cttgtcaaggactgcactcctcacacccacggtatgctcgctgtcaagggtggcgctgaa3120gccatccgtgacgtcctcggctccaagatgaccgagattgcctgcatcaacggtcctgag3180gagactgtactttgcggtagtggcgaggttgttagtgctgccaacgagactctttccgct3240cgcggcttcaaggccaccaagctcaatgttcccttcgccttccactcggcccaggtcgac3300cctatcctcgagtccttcaagaaggttgcttcctgcgtcaccttcaacaagcccgctgtc3360cctgtcctctctcccctttccggagatgtcattcgcgaggctggtgttattggcccagac3420tacctcgctagacacgccagagagactgtcaacttctggaccgctctgaccactggtcag3480aaggagaagatcttcgatgagaagactgcttggctcgaggttggcgctcaccccgtctgc3540tctggcatggtcaaggcttctgtcggtgccaccgtcaccgctccttcgctccgtcgcaac3600gaggacccctggaagactatcgccaccagtgtttgcgccctcttcaacgctggtgtccag3660atcaacttcgatgagtaccaccgtgaattcaatgctgctcaggaacttcttcctctgccc3720acctactctttcgacaacaagaagtactggctcgactaccagaacaactggactcttacc3780aaaggtgaggcccgcgaggtccagaagactattgaggccgcccctcaagctgcccctgtc3840gtcgagaagcccgctaagcgcctctccacttcctgtcagaaggttatccacgaggagttc3900gaggccaactctggtaccgttgtcattcagtccaacgttgccgagcccaagctcttccag3960gctgtcattggtcaccaagtcaacgacactgccctctgcccctcgtccctgtacgctgac4020atggcattgactgtctgcgactacctttacaagcagctcagaccctctgcccccaagatt4080ggcatgaacgtctgcgagatggaggtccctaagcccttcatcgccaagatggagcagccc4140gctgaaggtcagcacatccaactcgaggccaaggctgacctcgacgagggtgtcgctcat4200ttgaagttcagaagtgtcactcccgatggcaagctcatccaagaccatgctcac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