茄子果色上位性基因D的定位及其InDel分子标记开发与应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及茄子果色上位性基因D的定位及其InDel分子标记开发与应用。
背景技术：
：茄子果色遗传是多基因控制的复杂性状。发明人在茄子育种实践中发现2对上位性效应基因控制的茄子果色遗传现象（图1）。即2个纯合的白果色茄子杂交后，F1代果色为紫红色，F2代紫红果色和白果色植株分离比为9:7，说明其果皮着色受到具有上位性的2个基因位点控制的，2个白果色茄子是由于控制花青素生物合成过程的2个独立而又互补的基因位点（D基因和P基因）分别失活引起的。目前有关茄子果色上位性基因尚未开展相关分子标记及定位研究。因此，开展茄子果色上位性基因的分子标记和定位研究，可以为茄子果色分子标记辅助选择育种及基因克隆奠定基础。技术实现要素：本发明的目的在于提供茄子果色上位性基因D的定位及其InDel分子标记开发与应用。本发明所采取的技术方案是：采用SLAF-Seq与BSA关联分析技术结合，将控制茄子果色上位性遗传的2个基因（D和P）分别定位到相应的两个较小的区域。由于控制性状的是两对独立的等位基因且分离比为9:7，确定两个混池基因型的分离比（紫色混池D:紫色混池d：白果混池D：白果混池d）为6:3:2:5，通过卡方检验，共得到784个SNP位点（P>0.95）；将过滤得到的784个SNP用ED法进行关联分析，计算关联值，根据99百分位数确定关联阈值0.822。关联到的SNP列表见表1。从表1可见，控制茄子果色的上位性基因D定位于茄子的10号染色体上。并进一步检测到与控制茄子果色的上位性基因D紧密关联的分子标记，其位于茄子的10号染色体上，其关联区域所在核苷酸序列如Sme2.5_00538.1所示。本申请还进一步开发了与控制茄子果色的上位性基因D紧密连锁的InDel分子标记，其为长度29bp的特异插入片段，插入位点在基因序列Sme2.5_00538.1的第22522bp处。所述InDel分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。用于扩增权利要求2或3所述InDel分子标记的引物对，其核苷酸序列如下所示：22522F2：5'-ACCGAGCCATTAGGACCTCTTGT-3'，22522R2:5'-GGGAGTCCGATGCAAATTCTTGT-3'。以上所述的分子标记、InDel分子标记、引物对在茄子果色选育中的应用。茄子果色上位性基因D的基因型检测方法，包括如下步骤：（1）利用上述引物对PCR扩增待检植株DNA；（2）如果扩增产物中仅有440bp片段，则该植株基因型为dd；如果扩增产物中仅有469bp片段，则该植株基因型为DD；同时有469bp和440bp两个片断的则基因型为Dd。本发明的有益效果是：本发明将控制茄子果色的1个上位性基因D定位于茄子的10号染色体上的较小关联区域内。并提供了与茄子果色上位性基因D紧密连锁的分子标记InDel22522，该标记距离目标基因D的遗传距离为0.61cM，可直接用于茄子果色上位性基因D分子标记辅助育种体系的建立。本发明的分子标记及分子标记扩增引物可以简便、快速、高通量地应用于茄子果色选育实践中，同时为克隆茄子果色上位性基因D及其功能研究奠定了良好的基础。附图说明图1为母本材料Female果色为白色，而且在整个生育期，下胚轴、叶脉，花，萼片都观察不到花青素的合成；父本Male果色为白色，苗期下胚轴微紫、叶脉泛紫，花色微紫，F1代材料下胚轴、叶脉、花色和果色都呈现紫红色。图2为InDel22522标记在F2分离群体白果色单株中的PCR扩增结果：M为100bpDNAladder；母本扩增长度为469bp（基因型DD）、父本扩增长度为440bp（基因型dd）；F1代单株扩增带型为469bp和440bp两条带（基因型Dd）；1-12为F2代分离群体单株，其中，1-6为绿茎白果色单株（基因型有DDpp、Ddpp、ddpp），7-12为紫红茎白果色单株（基因型有ddPP、ddPp）。图3为InDel22522标记在F2分离群体紫红果色单株中的PCR扩增结果：M为100bpDNAladder；母本扩增长度为469bp（基因型DD）、父本扩增长度为440bp（基因型dd）；F1代单株扩增带型为469bp和440bp两条带（基因型Dd）；1-12为F2代紫红果色单株（基因型有DDPP、DDPp、DdPP和DdPp）。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括DNA提取、PCR扩增、PAGE凝胶电泳等实验，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(SambrookJ,RussellDW，JanssenK,ArgentineJ.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1一、遗传群体的构建及遗传分析1、供试材料植物材料：以广东省农业科学院蔬菜研究所经多代严格套袋自交选育的2份白果色的茄子纯化自交系为父本（Male，基因型为ddPP）和母本(Female，基因型为DDpp)，配制杂交组合F1，F1单株自交得到F2。母本材料Female果色为白色，而且在整个生育期，下胚轴、叶脉，花，萼片都观察不到花青素的合成；父本Male果色为白色，苗期下胚轴微紫、叶脉泛紫，花色微紫，F1代材料下胚轴、叶脉、花色和果色都呈现紫红色（图1）。F2分离世代紫红和白果色植株的分离比经卡方检验符合9:7。2、遗传分析在F2代分离群体果色分为紫红果色（有花青素）和白果色（无花青素）。486个单株组成的F2群体中，紫红果色单株和白果色单株分别为259株和227株，卡平方（Ｘ2）检验其是否符合9：7比率，结果Ｘ2＝1.73（P=0.19），小于Ｘ20.05＝3.84（df=1），所以紫红果色单株总数和白果色单株总数符合9：7比率。因此，明确了本研究中所用的茄子材料果色遗传是受2个相互作用的上位性基因（D和P）控制的。二、茄子果色上位基因定位1、亲本及F2紫红果色池和白果色池DNA制备2个白茄父、母本各取10株苗期叶片，分别提取叶片DNA，每株取等量DNA混合，构成父本池和母本池；F2分离群体，苗期单株取叶片，分别提取DNA，坐果期进行果色调查，然后取100株果色为紫红的单株DNA等量混合构成紫红果色池，取100株果色为白的单株DNA等量混合构成白果色池。2、SLAF-seq结合BSA分析方法定位茄子果色上位性基因本研究前期委托北京百迈客生物科技有限公司利用其自主研发的SLAF-seq技术进行简化基因组测序（Sunetal.,2013），并结合集群分离分析方法（BSA）对茄子果色上位性基因进行定位。利用2014年9月公开的茄子基因组SME_r2.5.1（http://eggplant.kazusa.or.jp）序列信息，将1117个Scaffold上共231490个SNP对应到基因组上相应的Scaffold。然后过滤掉低深度的SNP位点，过滤掉亲本基因型相同以及杂合的SNP位点，最后过滤掉不符合分离比的SNP位点，共得到784个SNP位点。将过滤得到的784个SNP用ED法进行关联分析，计算关联值（表1），根据99百分位数确定关联阈值0.822。根据卡方检验和关联计算结果，将控制茄子果色的1个上位性基因D定位于茄子的10号染色体上，其关联区域所在核苷酸序列如Sme2.5_00538.1（http://eggplant.kazusa.or.jp）所示。（表1）。表1D基因位点关联到显著的SNP列表Sacffold名称位置对应连锁群对应MarkerED5关联值Sme2.5_00538.118818E10gg3107_17191.120Sme2.5_00538.118874E10gg3107_17191.052Sme2.5_00538.118886E10gg3107_17191.0523、分子标记InDel22522开发基于父、母本基因组重测序结果，在关联区域所在的ScaffoldSme2.5_00538.1附近寻找InDel标记，在序列Sme2.5_00538.1的第22522位点找到了一个InDel标记，其在母本中比父本中多了1个29个碱基的插入。序列如SEQIDNO.1所示：5’-TTGCTGATTCACTCATATGATTTTTTGGA-3’（SEQIDNO.1）。根据上述InDel标记设计了一组特异性引物对，该引物对可在母本中扩增出长度为469bp的片段（基因型DD），序列如SEQIDNO.2所示；可在父本中扩增出长度为440bp的片段（基因型dd），序列如SEQIDNO.3所示。如果同时有469bp和440bp两个片断扩增则基因型为Dd。所示引物对的核苷酸序列如下所示：22522F2：5'-ACCGAGCCATTAGGACCTCTTGT-3'（SEQIDNO.4），22522R2:5'-GGGAGTCCGATGCAAATTCTTGT-3'（SEQIDNO.5）。实施例2分子标记InDel22522的应用1、F2单株DNA制备以广东省农业科学院蔬菜研究所经多代严格套袋自交选育的2份白果色的茄子纯化自交系为父本（Male，基因型为ddPP）和母本(Female，基因型为DDpp)，配制杂交组合F1，F1单株自交得到F2，F2分离群体，共207株。父本、母本、F2单株苗期取叶片，分别提取DNA，坐果期进行果色调查。2、分子标记InDel22522在父本、母本、F2分离群体单株中PCR扩增检测扩增体系为20μL：ddH2O5μL，PCRmix(Genstar)10μL，22522F2引物（10μmol/L）1.5μL，22522R2引物（10μmol/L）1.5μL，DNA模板（500ng/μL）2μL。PCR反应程序为:94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃再延伸7min。反应结束后，分别取20µL产物在1.2%琼脂糖上电泳，Goldview染色后用凝胶成像系统观察拍照。3、PAGE胶电泳及显色PCR产物检测利用8％变性聚丙烯酰氨凝胶电泳检测，上样量为1μL，采用160V恒电压电泳2.5~3h。PAGE胶染色采用快速银染法，具体为：（1）从玻璃板上拆下胶置于蒸馏水中漂洗，并重复一次；（2）0.1%AgNO3溶液中染色10min；（3）蒸馏水漂洗2次；（4）1x显色液200ml+800μL甲醛中显色10分钟；（5）自来水漂洗2次后读带。4、检测结果检测结果如图2和图3所示。特异性引物对对母本的扩增长度为469bp（基因型DD）、父本的扩增长度为440bp（基因型dd）；F1代单株的扩增带型为469bp和440bp（基因型Dd）；对F2代白果色单株的扩增带型分2种情况考虑：一种情况是绿茎白果色单株，其可能基因型有DDpp、Ddpp、ddpp，因此D基因分子标记InDel22522扩增结果有3种情况，既469bp（基因型DD）、440bp（基因型dd）、469bp和440bp（基因型Dd），图2中（泳道1-6）为后2种情况的带型；另一种情况是紫红茎白果色单株，其可能基因型有ddPP、ddPp，因此D基因分子标记InDel22522扩增结果为440bp（基因型dd），如图2泳道7-12结果。对F2代紫红果色单株的扩增带型：F2代紫红果色单株可能基因型有DDPP、DDPp、DdPP和DdPp，因此D基因分子标记InDel22522扩增结果有2种情况，既469bp（基因型DD）、469bp和440bp（基因型Dd），如图3所示。InDel标记检测结果符合F2分离世代的果色分离与基因型的对应关系，说明本方法准确性高，可应用于茄子果色上位性基因D分子标记的辅助育种。SEQUENCELISTING<110>广东省农业科学院蔬菜研究所<120>茄子果色上位性基因D的定位及其InDel分子标记开发与应用<130><160>5<170>PatentInversion3.5<210>1<211>29<212>DNA<213>SolanummelongenaL.<400>1ttgctgattcactcatatgattttttgga29<210>2<211>469<212>DNA<213>SolanummelongenaL.<400>2accgagccattaggacctcttgtcgagctcgttgctgattcactcatatgattttttgga60ttgcggattcactcatatgattttttggaaatattgcatcggaccccctgcagcgccaga120attcgtgggctaacacccatagaaaactgctgaaatcgtttgtttcctgttccttggtcc180ataaaatcctatcaaacatccccccgccgccgctgggacacatacgcctcttgccaggct240cgttttggatccactcatataattttttgggaatgttgcgccagaccccctcagcgccag300aatccgtggggtaatacccatagaaaactgtcgaaatcatttgtttcctgttccttggcc360cataaaatcctaccaagcgtcccccgccgccacaaggccacctaagcctcttgctgagct420cgttacggacccattcatatgattttacaagaatttgcatcggactccc469<210>3<211>440<212>DNA<213>SolanummelongenaL.<400>3accgagcccataggacctcttgtcgagctcgttgcggattcactcatatgattttttggg60aatattgcgtcggaccccctgcagcgccagaattcgtgggctaacacccatagaaaactg120ctgaaatcgtttgtttcctgttccttggtccataaaatcctatcaaacatccccccgccg180ccgctgggacacatacgcctcttgccaggctcgttttggatccactcatataattttttg240ggaatgttacgccagaccccctcagcgccagaatccgtggggtaatacccatagaaaact300gtcgaaatcatttgtttcctgttccttggcccataaaatcctaccaagcgtccccctccg360ccacaaggccacctaaacctcttgttgagctcgttgcggacccattcatatgattttaca420agaatttgcatcggactccc440<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>4accgagccattaggacctcttgt23<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>5gggagtccgatgcaaattcttgt23当前第1页1 2 3