一种环介导等温扩增快速检测金藻的方法及试剂盒与流程

本发明涉及微生物分子检测技术领域，尤其是涉及一种采用环介导等温扩增技术快速检测金藻的方法及试剂盒。

背景技术：

金藻是小球藻大规模培养中存在的一种污染最严重的原生动物，它是一种鞭毛虫-Poterioochromonas sp.。该鞭毛虫具有自养与混合营养的特点，极易感染并快速吞噬小球藻，一经感染，可使小球藻大规模培养在短时间内完全溃败，从而给小球藻的大规模培养带来极大危害。因此对于小球藻培养中金藻的早期快速监测和分子鉴定方法的确定至关重要。

目前对金藻研究多局限于对其进行分离培养以及其对水华藻种的吞噬习性方面的研究，而对其进行早期监测方面的研究甚少，只停留在传统的显微镜观察、DNA一代测序及聚合酶链反应(PCR)阶段。传统的形态学观察灵敏度低，最低限度为10⁴cells/mL，在原生动物大量存在时适用，并且因为原生动物种类繁多，数量庞大，除了已知的形态学知识外，有很多形态上难以区分的物种，而DNA一代测序及聚合酶链反应(PCR)存在检测效率低，操作繁琐，耗费时间，假阳性概率大，经常影响对实际情况的判断，错过最佳污染控制的时机，不适合基层和现场检测。因此，建立一种简单且灵敏的金藻早期监测方法尤为重要。

LAMP(环介导等温扩增)是由Notomi于2000年开发的一种新型核酸扩增技术，该技术利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，借助具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，在恒等温条件下进行靶序列高效扩增，可合成10⁹-10¹⁰个数量级的靶标DNA。该技术避免了常规PCR对循环温度的特殊要求，并因其高效性、简易行、成本低廉且检测周期短等特点提升了它的应用价值。到目前为止，还没有将LAMP技术有效用于大规模微藻培养中的重要污染物金藻的早期监测。

技术实现要素：

本发明的目的是在仪器设备有限的环境中，提供一种能简便快捷准确的检测到金藻的方法，以实现对大规模微藻培养中的重要污染物金藻进行早期监测。

为了实现上述目的，本发明解决的第一个技术问题是：采用金藻CoI基因应用在环介导等温扩增技术快速检测金藻中。一般在选择检测目的基因时，对于真核生物，优先考虑的都是真核生物普遍存在的18S rRNA，但此基因具有高保守性，不适用于进行物种特异性分析。而本发明经过反复序列比对后，发现采用CoI基因作为分子标记进行等温扩增引物的设计，可以有效的将金藻在微藻培养过程中即使有其他污染原生动物存在的条件下也可以鉴定出来。CoI基因，细胞色素氧化酶I(CoI cytochrome c oxidase I)基因，这部分DNA序列能够准确区分出物种差异，具有每个物种的特异性，就像物种的“身份证”编号。在藻类培养过程中，会应对出现不同种微生物的污染，为了明确污染物的信息，本发明将金藻CoI基因作为目标监测的分子标记。同时由于原生动物基因序列相似度较大，如直接采用DNA直接测序及聚合酶链反应(PCR)，检测效率低，检测结果会出现假阳性的情况。故而本发明继续采用环介导等温扩增技术，将金藻CoI基因作为分子标记进行特异性筛选(如序列SEQ ID No.7所示)和设计引物，继而解决了第二个技术问题，进一步提供一组环介导等温扩增引物，其可特异性环介导等温扩增所述的分子标记。

所述引物组优选为：包括一对外引物，一对内引物和一对环状引物；所述外引物为F3和B3，其核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示；所述内引物为FIP和BIP，其核苷酸序列如SEQ ID No.3-4所示；所述环状引物为LF和LB，其核苷酸序列如SEQ ID No.5-6所示。

进一步的，本发明提供一种环介导等温扩增技术快速检测金藻的方法，以待测样品质粒和基因组DNA为模板，利用上述的特异性引物组进行环介导等温扩增反应。

方法还包括步骤：采用所述的特异性外引物F3和B3，将包含目的扩增片段的基因克隆到质粒pGEM-T中，构建的重组质粒pGEMT-CoI作为检测金藻拷贝数灵敏度的依据。

方法还包括步骤：将扩增产物进行凝胶电泳，如果出现特异性阶梯状条带，则判定样品中含有金藻，即为金藻阳性。

优选的，所述环介导等温扩增反应的反应体系包括：8U/μL的Bst DNA聚合酶：1μL；10×的Bst DNA聚合酶缓冲液：2.5μL；25mmol/μL的MgSO4：1.5μL；10mM的dNTPs：2.5μL；5mol/L的Betain：4μL；10mM的F3/B3引物：0.5μL；20mM的FIP/BIP引物：1.5μL；10mM的LF/LB引物：1μL；模板：1μL；H₂O：6.5μL。

优选的，所述环介导等温扩增反应的反应条件如下：65℃反应60min，80℃反应7min。

优选的，所述凝胶电泳是使用质量体积比为2％的琼脂糖凝胶，恒压120V电泳30min。

本发明的方法也可设计为金藻早期快速鉴定试剂盒。其具有对样本低要求，高效率，精确检测，省时省力省费用，效果显著等特点。所述试剂盒中包含所述的特异性引物。

具体的，所述试剂盒可以包括检测试剂和基因组DNA提取试剂。所述检测试剂包括特异性引物组、阳性标准品。所述基因组DNA提取试剂优选包括Roche的High Pure Template Preparation Kit试剂盒和Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit试剂盒中的一种。

本发明提供了一组快速检测金藻的环介导等温扩增引物及检测方法。所述引物组特异性强，灵敏度高，且具有很好的重复性。该方法可检测出的最低浓度分别可达到100copies/μL金藻线粒体CoI基因的存在和1000cells/mL金藻细胞的存在，比传统PCR技术的敏感度提高了1000倍，很好的解决了敏感性问题，对微藻培养污染物的早期监测具有重要意义。此外该方法操作简便，不需要特殊仪器，便于在条件有限的环境中进行大量的样品检测。

对本发明方法的灵敏度、稳定性、特异性以及对环境样品的有效性进行综合评价如下：

(1)灵敏度：用灭菌双蒸水分别将质粒定量标准品pGEMT-CoI稀释10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹cpies/μL，采用经优化后的体系进行检测，验证所建立的方法的灵敏度。本方法检测范围可达到8个数量级，其灵敏度可到100拷贝。

(2)特异性：本发明选取了22份样品进行特异性引物验证：5份轮虫样品，12份纤毛虫样品，2份变形虫样品，1份鞭毛虫样品，一份小球藻样品。采用环介导等温扩增方法进行检测，检测结果显示除了金藻外，其余样品均为阴性结果。

附图说明

图1为设计选择的三对引物进行可行性实验的初步筛选，其中M：100bp DNA Ladder；1：第一对引物；2：第二对引物；3：第三对引物；a：金藻基因组DNA作为模板；b：四膜虫基因组DNA作为模板；c：水对照；

图2为环介导等温扩增金藻基因组DNA中CoI基因引物的一对特异性引物的结果；

其中M：100bp DNA Ladder；1：江西褶皱臂尾轮虫；2：海南褶皱臂尾轮虫；3：云南褶皱臂尾轮虫；4：血球藻旋轮虫；5：北京水轮虫；6：四膜虫；7：海南腹柱虫；8：北京Sterkiella；9：云南前口虫；10：北京草履虫；11：刀刀口虫；12尖毛虫；13：北京钟虫Vorticella；14:海南扇形游朴虫；15:寡毛双眉虫；16:膜袋虫；17：CBN Vannella；18：武汉Heterolobosean；19：海南鞭毛虫Suigetsumonas clinomigrationis；20：小球藻；21:水；22：金藻；

图3为传统PCR扩增金藻质粒的敏感性结果：从左至右1-9分别为10⁹copies/μL的质粒标准品按十倍梯度稀释样品，浓度分别为10⁹～10¹copies/μL，M为DNA分子量标记，N为阴性对照；

图4为环介导等温扩增金藻质粒的敏感性结果：从左至右1-9分别为10⁹copies/μL的质粒标准品按十倍梯度稀释样品，浓度分别为10⁹～10¹copies/μL，M为DNA分子量标记，N为阴性对照；

图5为传统PCR扩增金藻基因组DNA的敏感性结果：从左至右1-8分别为10⁷cells/mL的细胞浓度按十倍梯度稀释样品，浓度分别为10⁷～10⁰cells/mL，M为DNA分子量标记，N为阴性对照；

图6为环介导等温扩增金藻基因组DNA的敏感性结果：从左至右1-8分别为10⁷cells/mL的细胞浓度按十倍梯度稀释样品，浓度分别为10⁷～10⁰cells/mL，M为DNA分子量标记，N为阴性对照；

图7为小球藻的细胞设定为10⁶个的添加实验检测的荧光信号图，从左至右小球藻与金藻的细胞比例分别为10²:1、10³:1、10⁴:1、10⁵:1、10⁶:1；

图8为小球藻的细胞设定为10⁷个的添加实验检测的荧光信号图，从左至右小球藻与金藻的细胞比例分别为10²:1、10³:1、10⁴:1、10⁵:1、10⁶:1、10⁷:1；

图9为小球藻的细胞设定为108个的添加实验检测的荧光信号图，从左至右小球藻与金藻的细胞比例分别为10²:1、10³:1、10⁴:1、10⁵:1、10⁶:1、10⁷:1、10⁸:1。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：引物的设计与合成

(1)引物设计筛选：根据金藻细胞色素氧化酶I(CoI cytochrome c oxidase I)基因序列设计合成若干对引物，并基于以下条件筛选其中可用于后续实验的引物。

a.序列GC含量，含量介于40％-65％的定义为普通序列，含量大于65％的定义为GC富集序列，含量小于40％的定义为AT富集序列；

b.引物长度基于GC含量不同，设置一下不同引物长度，如下表：

c.根据序列GC含量的不同，设置了不同引物的解链温度(Tm值)。

d.引物间距，F2和B2引物间距为120-180nt，F3与F2引物间距为0-20nt，F1c与B1c引物间距为0-100nt。

e.引物末端稳定性，引物末端稳定性采用引物末端6个碱基与靶标序列节后前后的自由能差值(△G)来衡量。自由能差值采用SantaLucia方法进行计算。F2、B2、F3、B3、LF、LB引物的3’短自由能差值应该≤-4kcal/mol，F1c、B1c引物的5’端自由能差值应该≤-3kcal/mol。

(2)引物组成：该方法主要是利用4种不同特异性引物识别靶基因的6个特定区域，且可在等温条件进行扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率高，可在15min-60min扩增10⁹-10¹⁰倍；特异性高，靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有，无来判定。有无扩增反应是利用电泳的阶梯状条带来判断的。

扩增原理：DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任意一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链会解离，变成单链。在链置换型DNA聚合酶的作用下，以FIP引物的F2区段的3’末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前端的F3c序列互补，以3’末端为起点，通过链置换型DNA聚合酶的作用，一边置换之前FIP引物合成的DNA链，一边合成自身的DNA，如此向前延伸。最终F3引物合成而得到的DNA链与模板DNA形成双链。由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行置换产生一条单链，这条单链在5’末端存在互补的F1c和F1区段，发生自我碱基配对，形成环状结构。同时，BIP引物同该单链杂交结合，以BIP引物的3’端为起点，合成互补链，在此过程中环状结构被打开。接着，类似于F3,B3引物从BIP引物外侧插入，形成碱基配对，以3’端为起点，在聚合酶的作用下，合成新的互补链。通过上述两过程，形成双链DNA。而被置换的单链DNA两端存在互补序列，自然发生自我碱基配对，形成环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构。该结构是环介导等温扩增法基因扩增循环的起始结构。至此为止的所有过程都是为了形成环介导等温扩增法基因扩增循环的起点结构。环介导等温扩增法基因扩增循环：首先在哑铃状结构中，以3’末端的F1区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸。与此同时，FIP引物F2与环上单链F2c杂交，启动新一轮链置换反应。通过此过程，结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构，直至完成模板的复制扩增。

根据以上设计和筛选，本发明最终选定三对特异性的外引物和内引物，以及环状引物。外引物为F3和B3，其核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示；内引物为FIP(由F1c和F2的序列组成)和BIP(由B1c和B2的序列组成)，其核苷酸序列如SEQ ID No.3-4所示；环状引物为LF和LB，其核苷酸序列如SEQ ID No.5-6所示:

F3：5’-GTTCTTGTAACAGGACATGC-3’；

B3：5’-AAACAGTCCATCCGGTAC-3’；

FIP：5’-GGCTCCTATCATTAATGGAGCAAAATAATGATTTTCTTCATGGTTATGCC-3’；

BIP：5’-GGCGTTCCCAAGGCTAAATAATATTAGCTTCTACTAATGCTGATGA-3’；

LF：5’-GTTTCCAAATCCTCCAATT-3’；

LB：5’-GTTATTACCACCTTCTTTAT-3’。

实施例2：质粒定量标准品的构建和制备

步骤：

1.质粒标准品的构建

利用PCR方法克隆得到含有靶基因序列的CoI基因片段，重组到载体pGEM-T中，并进行DNA序列测定。构建的重组质粒作为定量标准品，命名为pGEMT-CoI。

2.定量标准品的制备

质粒pGEMT-CoI用Omega质粒提取试剂盒进行提取纯化，根据Nanodrop8000测定的质粒的浓度及质量以及阿伏伽德罗常数换算成拷贝数。

计算公式如下：

一个碱基对的平均分子量为660g/mol；

质粒的总长度为载体的总长度加上插入片段的长度；

N：代表阿伏伽德罗常数(6.02×10²³copies/mol)。

实施例3：基因组DNA的提取

对纯培养的金藻和小球藻的培养液进行细胞计数，得到两者的细胞密度。各取2mL细胞培养液分别采用High Pure Template Preparation Kit(Roche)提取纯金藻DNA，用DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)DNA提取试剂盒提取两者混合的DNA，利用Nanodrop8000对DNA的浓度及质量进行测定。选取浓度和质量最佳的DNA保存备用。

实施例4：环介导等温扩增反应体系的建立

1.通过大量的实验探索，建立一个最优的环介导等温扩增反应体系及反应条件。

所述最优反应体系的具体成分及含量如下(25μL)

所述环介导等温扩增反应的反应条件如下：65℃反应60min，80℃反应7min。

所述凝胶电泳是使用质量体积比为2％的琼脂糖凝胶，恒压120V电泳30min。

实施例5：环介导等温扩增反应引物可行性的初步筛选

为检验所设计引物的可行性，将合成的三组引物进行样品的可行性分析，本发明选择阳性样品金藻基因组DNA，以及阴性四膜虫基因组DNA,以及水对照。采用环介导等温扩增方法进行检测，检测结果显示除了第一组引物所得结果符合要求外，其余样品均为阴性结果，结果见图1。

实施例6：环介导等温扩增反应引物特异性的验证

为检验环介导等温扩增反应引物的特异性，本发明选取了20份样品进行检测：5份轮虫样品，12份纤毛虫样品，2份变形虫样品，1份鞭毛虫样品，一份小球藻，一份水对照。采用环介导等温扩增方法进行检测，检测结果显示除了金藻外，其余样品均为阴性结果，结果见图2。

实施例7：环介导等温扩增反应的敏感性

1.模板质粒和基因组DNA

根据实施例2中公式计算，用灭菌双蒸水10倍梯度稀释定量标准品pGEMT-CoI。稀释后质粒浓度分别为10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹copies/μL，采用经优化后的体系和条件进行反应。

根据计数的结果，用灭据双蒸水10倍梯度稀释金藻细胞样品，进行基因组DNA的提取，稀释后细胞数分别为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰cells/mL，采用经优化后的体系和条件进行反应。2.传统PCR

以上述各梯度稀释液为模板，进行PCR扩增，反应结束，进行凝胶电泳检测。

3.环介导等温扩增反应

以上述各梯度稀释液为模板，利用实施例4中所述反应体系，进行环介导等温扩增反应，反应结束后进行凝胶电泳检测。

结果表明，传统PCR扩增后，对于质粒标准品的敏感性检测底线是10⁵copies/μL，如图3；对于金藻基因组DNA检测敏感性是10⁵cells/mL，如图5。

以本发明提供的引物进行环介导等温扩增，对于质粒标准品的敏感性检测底线是10²copies/μL，可见敏感性比传统PCR提高了1000倍，如图4；对于金藻基因组DNA检测敏感性是10³cells/mL，比传统PCR敏感性提高了100倍，如图6。

实施例8：金藻和小球藻添加实验

步骤：

1.小球藻的细胞设定为10⁶个

分别取10⁰、10¹、10²、10³、10⁴个金藻细胞，按照小球藻与金藻细胞比例依次为10⁶:1、10⁵:1、10⁴:1、10³:1和10²:1，按照实施例2和3所述的方法对其提取核酸。采用经优化后的体系和条件进行反应。结果显示当小球藻与金藻细胞比例等于10³:1时可有效的检测到金藻的存在，检测结果见图7。

2.小球藻的细胞设定为10⁷个

分别取10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵个金藻细胞，按照小球藻与金藻细胞比例依次为10⁷:1、10⁶:1、10⁵:1、10⁴:1、10³:1和10²:1，按照实施例3所述的方法对其提取核酸。采用经优化后的体系和条件进行反应。结果显示当小球藻与金藻细胞比例等于10⁴:1时可有效的检测到金藻的存在，检测结果见图8。

3.小球藻的细胞设定为10⁸个

分别取10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶个金藻细胞，按照小球藻与金藻细胞比例依次为10⁸:1、10⁷:1、10⁶:1、10⁵:1、10⁴:1、10³:1和10²:1，按照实施例2和3所述的方法对其提取核酸。采用经优化后的体系和条件进行反应。结果显示当小球藻与金藻细胞比例小于等于10⁶:1时可有效的检测到金藻的存在，检测结果见图9。

从以上实施例的实验可以看出，本发明的检测方法能快速、准确的检测出金藻的存在，所述引物特异性强，灵敏度高，且具有很好的重复性。该方法可检测出的最低浓度分别可达到100copies/μL金藻线粒体CoI基因的存在和1000cells/mL金藻细胞的存在，比传统PCR技术的敏感度提高了1000倍，很好的解决了敏感性问题，对微藻培养污染物的早期监测具有重要意义。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 国家开发投资公司；中国科学院水生生物研究所

<120> 一种环介导等温扩增快速检测金藻的方法及试剂盒

<130> P1610220

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gttcttgtaa caggacatgc 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaacagtcca tccggtac 18

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggctcctatc attaatggag caaaataatg attttcttca tggttatgcc 50

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggcgttccca aggctaaata atattagctt ctactaatgc tgatga 46

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtttccaaat cctccaatt 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gttattacca ccttctttat 20

<210> 7

<211> 714

<212> DNA

<213> 金藻CoI基因

<400> 7

ggtcaacaaa tcataaagat attggtattt tatatatcat cttcggagca ttctctggag 60

tattagggac aactatgtct gttcttataa gaatggagct atcacaacct ggtagtgaaa 120

ttttacacgg aaattttcaa ttatataatg ttcttgtaac aggacatgct tttttaatga 180

ttttcttcat ggttatgcct atattaattg gaggatttgg aaactttttt gctccattaa 240

tgataggagc ccctgatatg gcgttcccaa ggctaaataa tatttcattc tggttattac 300

caccttcttt attattgtta ttatcatcag cattagtaga agctggacct ggtaccggat 360

ggactgttta tcctccttta tctagtattc aagctcattc aggaccttct attgatttag 420

ctatcttcag cttacattta tctggagcag cttctatttt aggttctata aattttatta 480

ctactatttt taatatgaga gcgcctggta tgttaatgca tagattacct ttatatgtat 540

ggtctgtatt agtaacatct tttttattag tactttcatt acctgtatta gggggtggaa 600

ttaccatgtt attaacagac agaaacttca atacaacttt ctttgaccct tgtggaggag 660

gagacccaat actatatcaa catttattct gattttttgg tcaccctgaa gttt 714