橡胶树棒孢霉落叶病菌CAS5亚型菌株的分子检测方法与流程

本发明属于橡胶树棒孢霉落叶病的病原菌检测技术领域，具体涉及一种检测橡胶树叶片携带棒孢霉落叶病病原菌CAS5亚型菌株的方法及引物。

背景技术：

天然橡胶是世界四大工业原料之一，我国是世界上最大的天然橡胶消费国，虽然也是生产国家之一，但远远不能满足国内的需求。如何保证天然橡胶生产的稳定和提高，是当前亟待解决的问题。

由多主棒孢(Corynespora cassicola)引起的棒孢霉落叶病(Corynespora leaf fall disease，CLFD)是继南美叶疫病(South American Leaf Blight，SALB)之后第二个威胁世界天然橡胶产业的重要病害，现已成为亚洲和非洲等天然橡胶产区最具破坏性的病害之一。近年调查发现，该病已成为危害我国橡胶树苗圃的主要病害，疫情发展迅速，潜在威胁巨大。该病在橡胶树的各个生理期均能发生，主要为害橡胶树叶片，引起橡胶树反复落叶、树冠稀疏，影响幼苗和幼树生长，降低开割树产胶量。该病在叶片上表现出多种症状，除了“鱼骨状”的典型症状，还包括圆斑和回枯等症状。该病害有些症状易与白粉病和炭疽病的病害症状混淆。因此，给该病害的准确鉴定带来了一定的困难。

寄主选择性毒素cassiicolin是橡胶树多主棒孢的主要致病因子。目前，国外已经明确了橡胶树上的多主棒孢存在5个cassiicolin毒素亚型，根据毒素亚型和寄主专化性将该病害的病原菌分为多个生理小种。具有Cas1亚型菌株致病性最强，主要分布在菲律宾和喀麦隆、加纳等非洲国家。Cas3和Cas4亚型均来自于巴西橡胶树内生多主棒孢菌株。Cas5亚型菌株则来源于马来西亚、斯里兰卡等亚洲国家的橡胶树。还有一些橡胶树多主棒孢菌株未检测到cassiicolin基因，划分为Cas0型，主要分布于马来西亚、斯里兰卡、印度和泰国等亚洲各植胶国家。而我国橡胶树多主棒孢主要有Cas2、Cas5和Cas0三种类型，其中Cas5亚型为优势群体，危害最严重。对病原菌进行准确鉴定，进而对病害进行快速的早期诊断，具有重要实际应用价值。

目前，只是建立了橡胶树棒孢霉落叶病病原菌多主棒孢的特异引物和PCR检测方法，还没有多主棒孢种以下小种或亚型的特异引物和PCR检测方法。

技术实现要素：

本发明根据cassiicolin毒素编码基因序列设计了一对橡胶树多主棒孢Cas5亚型菌株的特异性检测引物，并建立了PCR检测方法，实现高效准确的对橡胶树棒孢霉落叶病病原菌的分子检测。

本发明的目的之一是提供一对多主棒孢Cas5亚型菌株的特异引物,以及特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的橡胶树棒孢霉落叶病分子检测方法。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

对橡胶树棒孢霉落叶病发病叶片进行取样，提取样品基因组DNA作为模板，以

上游引物CAS5F：5’-CGAATGACAGCCAGGAG-3’(序列表中序列1)；

下游引物CAS5R：5’-ATATAGCGCCAATTGTA-3’(序列表中序列2)；

进行PCR扩增，

PCR扩增反应体系中含有待测样品DNA，2.5μL含15mM MgCL2的10×PCR缓冲液，2μL浓度为2.5mM dNTP,浓度为10μmoll-1上游正向引物和下游反向引物各1μL，；1U的Taq DNA聚合酶，加双蒸水补足到25μL；

PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s,72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min。

取5μL PCR产物用质量分数1.2％琼脂糖凝胶电泳进行分离。染料染色后根据有无扩增产物判定结果，扩增产物中含有350bp的条带，则待测样品中带有多主棒孢Cas5毒素亚型菌株。

本发明的有益效果为：上述引物可应用于引起橡胶树棒孢霉落叶病病原菌多主棒孢Cas5亚型菌株的鉴定和检测，可以在菌量较少的情况下检测到病原菌多主棒孢Cas5亚型菌株的存在。实验证明，当待测样品达到10pg时即可检出，表明该方法具有较高的灵敏性。同时，本发明的引物可以缩短对病原菌菌种的鉴定时间，从而达到快速高效鉴定菌种的目的。

所发明的检测方法适用于橡胶树棒孢霉落叶病病原菌(Corynespora cassiicola)和田间带菌橡胶树组织高灵敏度快速检测，为橡胶树棒孢霉落叶病的早期诊断和及时预防提供可靠地理论依据和技术方法。

附图说明

图1为本发明特异性引物检测样品DNA扩增后的凝胶电泳图。

图2为本发明的引物灵敏度检测结果。

具体实施方式

实施例1、本发明的用于快速检测多主棒孢Cas5亚型菌株引物的获得及其应用

一、用于快速检测多主棒孢Cas5亚型菌株引物的获得

将本实验室测序获得的不同亚型的cassiicolin毒素编码基因序列与NCBI数据库中已登录6个亚型的cassiicolin毒素编码基因序列进行比对分析，根据Cas5亚型与其它亚型间的差异位点设计特异引物，所得引物即为本发明的引物，引物序列为上游引物CAS5F：5’-CGAATGACAGCCAGGAG-3’(序列表中序列1)；下游引物CAS5R：5’-ATATAGCGCCAATTGTA-3’(序列表中序列2)。

二、本发明用于多主棒孢Cas5亚型菌株的快速检测引物的效果验证

1、引物合成

上游引物CAS5F：5’-CGAATGACAGCCAGGAG-3’；下游引物CAS5R：5’-ATATAGCGCCAATTGTA-3’由华大基因生物技术有限公司合成。

2、特异引物的准确性验证

以下为研究所用菌株：8株Corynespora cassiicola Cas5亚型菌株；3株Corynespora cassiicola Cas2亚型菌株；2株Corynespora cassiicola Cas0亚型菌株；1株胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)；1株尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatun)；1株橡胶粉孢(Oidium.hevea)。

上述菌株除了橡胶粉孢(Oidium.hevea)的基因组DNA从发病组织直接提取，其它菌株均保藏于中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。菌株相应的分离自我国海南、云南、广东等植胶区的橡胶树棒孢霉落叶病病样，所有菌株都经过了形态鉴定和ITS序列的分子鉴定，多主棒孢菌株还进行了毒素亚型的分子鉴定。

3、提取病原菌DNA

(1)从生长7d的转化子培养物边缘打取菌丝块，将菌丝转接到50mL马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)中，25℃，200rpm振荡培养4-5d；

(2)将生长了5d的菌丝真空抽滤，用Whatman No.1滤纸过滤收集菌丝体，然后用无菌水清洗菌丝体3次，置于真空冷冻干燥仪中干燥，放于－80℃冰箱，备用；

(3)用预冷的研钵和研磨棒在液氮中充分迅速的将1g菌丝体研磨成粉状。将研磨粉碎的菌丝体分装于50mL离心管中(注意分装时离心管应预冷，且粉状菌丝要一直处于冷却状态以防止DNA降解)。加入15mL预热(65℃)的CTAB提取缓冲液，充分振荡均匀，65℃下水浴1h，期间10min振荡一次；

(4)加入3mL 5mol/L KAc，冰浴20min；

(5)加入氯仿：异戊醇(24：1)，4℃10,000rpm离心5min；

(6)取上清转入另一个干净的50mL离心管中，加入0.6V体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀后，-20℃静置30min；

(7)用毛细管挑出絮状沉淀，75％的乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗一次，倒置离心管于干净的吸水纸上，在灭菌的工作台中吹干沉淀；

(8)将沉淀重悬于500μL的TE缓冲液中，加入1μL RNaseA(10mg/mL)，37℃处理1h；

(9)将上步所获的溶液转入干净的2mL离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，来回颠倒离心管数次将其混匀，4℃10,000rpm离心10min；再用氯仿：异戊醇(24：1)抽提一次；

(10)吸取上清转入干净的2mL离心管中，加入1/10体积预冷的3mol/L NaAc(PH5.2)，2.5V体积预冷的无水乙醇，-80℃沉淀30min以上，4℃12,000rpm离心30min。弃上清，用70％的乙醇洗一次，吹干后溶于500μL的TE，-20℃保存备用。

4、病原菌ITS的PCR扩增

以步骤3提取的8株Corynespora cassiicola Cas5亚型菌株；3株Corynespora cassiicola Cas2亚型菌株；2株Corynespora cassiicola Cas0亚型菌株；1株胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)；1株尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatun)；1株橡胶粉孢(Oidium.hevea)样品基因组DNA分别作为模板，以

上游引物CAS5F：5’-CGAATGACAGCCAGGAG-3’；

下游引物CAS5R：5’-ATATAGCGCCAATTGTA-3’；

进行PCR扩增，PCR扩增反应体系中含有待测样品DNA，2.5μL含15mM MgCL₂的10×PCR缓冲液，2μL浓度为2.5mM dNTP,浓度为10μmol/l上游正向引物和下游反向引物各1μL，；1U的Taq DNA聚合酶，加双蒸水补足到25μL；

PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s,72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min。

取5μL PCR产物用质量分数1.2％琼脂糖凝胶电泳进行分离。染料染色后根据有无扩增产物判定结果，扩增产物中含有350bp的条带，则待测样品中带有多主棒孢Cas5毒素亚型菌株。

结果如图1所示，结果表明，8株Corynespora cassiicola Cas5亚型菌株(图1中泳道1-8)均扩增出350bp的条带，而其他病原菌(泳道10-17)均为扩增到相应条带。说明本发明的方法准确性很高。

将其中一株Corynespora cassiicola Cas5亚型菌株的基因组DNA定容，然后依次稀释十倍，用上述方法进行扩增，结果表明，当待测样品在扩增体系中达到10pg时即可检出，表明该方法具有较高的灵敏性(图2，图2的泳道1-7为依次十倍稀释的Corynespora cassiicola Cas5亚型菌株的基因组DNA)。

以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围内。

序列表

<110>中国热带农业科学院环境与植物保护研究所

<120> 橡胶树棒孢霉落叶病菌CAS5亚型菌株的分子检测方法

<130> WHOI160084

<160>2

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

cgaatgacag ccaggag 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

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