本发明涉及分子标记应用技术领域，更具体地，涉及一组与清远麻鸡标准羽色相关的分子标记及其应用。
背景技术：
清远麻鸡作为国内驰名的优质地方品种，深受消费者喜爱。标准清远麻鸡的外貌特征为：公鸡胸部为纯黑色无杂色，背部整体为红色，其飞羽半红半黑；母鸡胸部颜色为浅橙色无杂色，背部褐色且有不规则分布的麻点。
实际育种过程中育种者一般通过观察个体表型对清远麻鸡的羽色进行选择，但是由于羽色的复杂性，关于其羽色的选育进展到一定程度后，进展非常缓慢，始终有一定比例（5～10%）的非标准羽色（如：公鸡的胸部有黄色的横斑存在，母鸡的胸部有黑色的横斑存在）。育种者为了解决羽色统一的问题一般采用测交的方法，其做法是标记每只母鸡个体的蛋，待出孵后至羽色稳定观察并记录其羽色，根据后代羽色淘汰不合格的父母代母鸡。该方法有以下缺点：（1）周期长，从入孵到能够判定羽色至少需要3个月时间；（2）工作量大，每只母鸡的蛋必须标记清楚；（3）过程繁琐，容易出错，其过程为首先需要在产蛋舍记录每只种蛋的母亲，然后需要在孵化机内对种蛋分组孵化，出雏后对分组的个体带翅号进行标记，然后是60日龄左右的时候对鸡只进行表型鉴定确认需要淘汰的母鸡。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种与清远麻鸡标准羽色相关的分子标记。
本发明的第二个目的是提供所述分子标记的应用。
本发明的第三个目的是提供一种选育清远麻鸡标准羽色个体的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
一组与清远麻鸡标准羽色相关的分子标记，所述分子标记为MC1R基因从N端起第668位的T/C碱基突变，和第730位的G/A碱基突变，和第854位的T/C碱基突变，和第883位的A/G碱基突变，和第1100位的A/C碱基突变。
本发明检测了具有标准羽色的清远麻鸡相关突变位点组成的单倍型情况。结果显示所检测的24个个体中的48个单倍型中，有44个为hap_1（对应野生型等位基因e+），4个为非e+等位基因，上述结果初步说明了e+等位基因是导致清远麻鸡标准羽色的致因突变。
因此，若样本DNA序列的第668位的T/C碱基突变，和第730位的G/A碱基突变，和第854位的T/C碱基突变，和第883位的A/G碱基突变，和第1100位的A/C碱基突变，即为清远麻鸡标准羽色。
因此本发明还提供所述分子标记在清远麻鸡羽性状辅助选择中的应用。
不同的毛色相关基因的变异导致了个体不同的毛色表型。通过研究确认了清远麻鸡羽色相关的基因变异，当把控制清远麻鸡羽色的等位基因纯合后，羽色则不再出现分离；符合清远麻鸡羽色标准的公母鸡交配，总会出现一定比例不符合清远麻鸡羽色标准的个体，这是生产中不想出现的。本发明通过分子标记辅助选择的方法选择符合要求的个体，淘汰不合格的个体，从而建立清远麻鸡纯系，该纯系纯繁时99.5%的个体符合清远麻鸡的羽色要求。
本发明还提供一种筛选标准羽色清远麻鸡的方法，具体是测定待测清远麻鸡MC1R基因的N端起第668位、第730位、第854位、第883位和第1100位的碱基，如果第668位、第730位、第854位、第883位和第1100位的碱基分别是T、G、T、A、A，则待测清远麻鸡为标准羽色清远麻鸡，否则不是标准羽色清远麻鸡。
更具体地，所述方法是设计引物MC1R-F和MC1R-R，对待测清远麻鸡的MC1R基因进行PCR扩增，将所得扩增产物直接进行测序，若扩增产物从N起第668位的碱基为T，第730位的碱基为G，第854位的碱基为T，第883位的碱基为A，第1100位的碱基为A，则待测清远麻鸡为标准羽色的清远麻鸡，否则，待测清远麻鸡为杂合羽色的清远麻鸡；所述引物MC1R-F和MC1R-R的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
优选地，所述PCR扩增的反应体系：DNA 1μL、2×EasyTaq PCR SuperMix 15μL、MC1R-F 0.3μL、MC1R-R 0.3μL，双蒸水补足30μL。
优选地，所述PCR扩增的条件为：（1）95℃ 3min，94℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 60s，35个循环；（2）72℃ 3min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一组与清远麻鸡标准羽色相关的分子标记，所述分子标记为MC1R基因从N端起第668位的T/C碱基突变，和第730位的G/A碱基突变，和第854位的T/C碱基突变，和第883位的A/G碱基突变，和第1100位的A/C碱基突变；利用该分子标记，通过PCR扩增待测样本，即可挑出清远麻鸡标准羽色的纯合子，从而剔除清远麻鸡标准羽色的杂合子个体，将其遗传背景统一，建立清远麻鸡纯系；该纯系自繁时99.5%的个体符合清远麻鸡的羽色要求。该方法准确率接近100%，操作简便，用时短，速度快，从拿到待检个体血样到决定被检个体的选淘只需要2天时间，每人每天至少可以完成144个体的检测，具有广泛且实际的应用价值。
具体实施方式
下面将结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。
实施例1 标准羽色清远麻鸡相关基因突变检测
一、引物设计与合成
以NCBI数据库中的序列（GenBank：D78272.1，序列如SEQ ID NO：1所示）为模板，利用genetool设计引物，引物序列以及扩增产物长度见表1，引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成。
二、被检个体样本采集
选择符合清远麻鸡羽色标准的清远麻鸡24个个体。采用一次性注射器从鸡翅下静脉中抽取约1mL血液，注入经高压灭菌并装有约200μL 2%无菌EDTA（Ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）抗凝剂的1.5mL离心管中，轻轻摇匀，-20℃保存备用。
三、DNA 抽提
基因组DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法（奥斯泊F等，1998）：
（1）取全血30μL置于1.5mL离心管，分别加入470μL1×SET缓冲液、12.5μL20%SDS和6μL10mg/mL蛋白酶K，混合均匀后放于55℃水浴过夜；
（2）取出样本于1.5mL离心管，加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
（3）取上清，再次加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
（4）取上清，加入500μL氯仿-异戊醇（23：1）轻摇20min，10,000rpm离心10min；
（5）取上清，加入1mL冰无水乙醇（-20℃），来回摇摆以沉淀DNA，10,000rpm离心10min后倒出乙醇；
（6）用1mL75%乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；
（7）待DNA完全干燥后加入300μL灭菌后的双蒸水溶解，50℃水浴锅中过夜以溶解DNA；
（8）存放于-20℃冰箱中保存备用。
四、PCR扩增
反应体系：DNA 1μL、2×EasyTaq PCR SuperMix 15μL、MC1R-F 0.3μL、MC1R-R 0.3μL，双蒸水补足30μL。
反应条件为：（1）95℃ 3min，94℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 60s，35个循环；（2）72℃ 3min。
反应后进行测序：（1）测序所得结果采用DNAstar中SeqMan功能模块进行拼接组装，利用MegAlign模块进行序列比对筛选变异位点。并且将每个个体的测序结果整理出来，杂合子使用简并碱基代码标记；（2）将步骤（1）中整理的测序结果，导入软件DNAsp5.0，输出被检个体的单倍型情况，结果如表2。
对上述结果统计如表3，结果说明，清远麻鸡羽色的致因等位基因为hap_1（即e+），可用该等位基因对清远麻鸡的羽色进行分子标记辅助选择。
实施例2 清远麻鸡羽色的分子标记辅助选择
由实施例1中的结果可知，控制清远麻鸡羽色的等位基因是hap_1（即e+），本实施例通过分子标记辅助选择的方法，将上述等位基因（hap_1）纯合的个体挑选出来组成新的群体进行自繁，并且观察后代的羽色情况。
经过分子标记辅助选择，hap_1等位基因纯合的公鸡个体10只，母鸡个体100只。
将纯合的个体挑选出来组成新的群体进行自繁的过程为：
（1）人工受精以及集蛋
用选出的个体组成新的群体进行自繁，混精受精。组成新群体7天后开始集蛋。连续集蛋7天。
（2）孵化：按照孵化要求将搜集的种蛋进行孵化。
（3）后代羽色表型的观察统计
将得到的580羽后代（公295，母285）饲养至120天，观察羽色情况。结果显示293只公鸡羽色符合清远麻鸡公鸡的标准羽色，284只的母鸡符合清远麻鸡母鸡的标准羽色，后代99.5%的个体符合清远麻鸡的羽色要求。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一组与清远麻鸡标准羽色相关的分子标记及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1538
<212> DNA
<213> 扩增片段
<400> 1
atcccaaggt acacagtgac ccgctgtgca cggtgcccca gcatggctca gcccccagct 60
accggggcac aggctgtcat gtgcgtgccc acccttctca ggaggaggag ccgagggagc 120
cagctttaaa tcaggacaga gaaagggccc tttcttcccc atcaccgccg ctgagccctc 180
tctgagctcc ggatacgccg ggcagtgccg gtggggaggg cggccgagac agcggagtcc 240
ccgcgctgct gcccagaggg ctcccgggtg ggggaccgct tccccatcct tgtgcctggg 300
gtgcagaggt gcccacatcc cctctgcctc gtgaccgcgt gctgcgggag cactggtggg 360
gctggttggg cgcacggggg ctttgtaggt gctgcagttg tgcctcgggg ccacggcctc 420
cagccagggc ggtccctggg ggctgaggcc ggggccatgt cgatgctggc ccccctgcgc 480
ctcgtgcgcg agccctggaa cgccagtgag ggcaaccaga gcaatgccac ggccggggcc 540
ggaggtgcct ggtgccaggg gctggacatc cccaatgagc tcttcctgac gctggggctg 600
gtgagcctgg tggagaacct gctggtggtg gccgccatcc tcaagaacag gaatctgcac 660
tcgcccatgt actacttcat ctgctgcctg gccgtctccg acatgctggt gagcgtcagc 720
aacctggccg agacgctctt catgctgctg atggagcacg gcgtgctggt gatccgcgcc 780
agcatcgtcc gccacatgga caatgtcatc gacatgctca tctgcagctc cgtcgtgtcc 840
tccctctcct tcctgggggt catcgccgtg gaccgctaca tcaccatctt ctatgcgctg 900
cgctaccaca gcatcatgac gctgcagcgc gccgtggtca ccatggccag cgtctggctg 960
gccagcaccg tctccagcac cgtcttaatc acctactacc gcaacaacgc catcctgctc 1020
tgcctcattg gcttcttcct cttcatgctg gtcctcatgc tggtgctcta cattcacatg 1080
ttcgcgctgg cgcgccacca cgtgcgcagc atctccagcc agcagaagca gcccaccatc 1140
taccgcacca gcagcctgaa gggagccgtc acgctcacca tcctgctggg agtcttcttc 1200
atctgctggg ggcccttctt cttccacctc atcctcatcg tcacctgccc caccaacccc 1260
ttctgcacct gcttcttcag ctatttcaac ctcttcctca tcctcatcat ctgcaattca 1320
gtggtcgatc ccctgatcta tgccttccgg agccaggagc tccggcggac gctgcgggag 1380
gtggtgctgt gctcctggta ggaggcggca cagacaggag gatggatgga tggatggatg 1440
gacggatgga cggatggatg gatggacaaa cagatgggtg gatggacaga tgggtggatg 1500
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<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> MC1R-F
<400> 2
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<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> MC1R-R
<400> 3
gggcacccag gggacacc 18