利用花生子叶快速获得转基因花生的方法及其应用与流程

本发明涉及植物转基因技术领域，特别涉及一种利用花生子叶为受体，通过农杆菌介导的花生转基因的方法及其应用。

背景技术：

利用在大量的转基因群体进行优良株系的选育对利用转基因技术进行作物遗传改良最为直接有效。大规模的转基因群体是进行商业化转基因育种的保障之一。因此、快速简便的转化方法是作物转基因育种过程中重要的一环。

花生(Arachis hypogaea L.)是一种重要的油料兼食作物，也是我国主要的油料经济作物，也是重要蛋白质来源。花生的转基因育种相对滞后，主要是在遗传转化上相对比较困难。近年来通过研究者的不断努力，花生的转基因技术有了一定的进展，初步建立农杆菌和基因枪介导的转化方法。虽然也获得了一些转基因植株，但是都没有后续的报道，而且这些方法大多依赖于组织培养，转化的效率也不高，操作步骤又相对复杂，很难适应大规模花生转基因育种的开展。特别是随着花生基因组的完成，大量功能基因的验证需要更为简单有效的转基因技术和方法。快速，简便的转基因方法也能开展大规模的转基因育种和商业化应用。在研究中发现，花生种皮在种子萌发中有一定的抑制作用，同时也容易导致培养基的褐化，在利用种子进行转化的时候都需要去掉种皮。但花生种皮和子叶的结合非常牢固，不容易分离开，导致工作量非常大，效率低下，是限制种子作为受体的主要因素之一。目前也有非组织培养的方法成功。在“在以花生半片成熟种子为受体的非组织培养基因转化方法”(201110074925.7)中同样也需要人工去除种皮，同时也需要单独分离子叶，工作效率十分低下，严重限制大量制作转基因受体，从而导致转化效率不高。排除受体制作的限制，大量获得受体进行花生的遗传转化，特别是适合农杆菌介导的侵染的材料有利于提高转基因的效率。建立高效的转基因方法也能开展大规模的转基因育种也有利于转基因花生的培育和商业化应用。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用花生子叶快速获得转基因花生的方法，该转基因方法取材容易、操作简单、节约时间和成本，且转化效率高，适用于大规模转基因花生的研制。

本发明的另一目的在于提供该转基因方法在制备转基因花生中的应用。

本发明的目的采用以下技术方案实现：

利用花生子叶快速获得转基因花生的方法，包括以下步骤：

1)取处于对数生长期的含有外源基因的农杆菌，重悬于第一培养基中，得到转化菌液；

2)取成熟的花生种子，萌发0-5天，然后将子叶纵切为两半，再切掉胚轴顶端的胚芽，得到转化受体；

3)将所述转化受体浸泡在转化菌液中，侵染20-50分钟，接着取出转化受体，吸干表面的液体，再置于吸水纸上，于22±2℃暗培养3-4天；培养过程中，向吸水纸上喷施液体营养液，使得吸水纸保持湿润；所述液体营养液为含有1-10mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)的MS培养基；

4)将经步骤3)处理的转化受体冲洗干净，利用第二培养基进行选择培养，得到花生幼苗；所述第二培养基为含有1-10mg/L的6-苄氨基腺嘌呤和0.2-0.4vol.％的抗性筛选物质的MS培养基；所述抗性筛选物质用于筛选含外源基因的花生；

5)将所述花生幼苗继续培养至得到花生植株，对花生植株进行鉴定，即可确定转基因植株。

优选的，在步骤1)中，所述的外源基因为双丙酰磷抗性基因(Bar)，所述抗性筛选物质为草胺膦。

优选的，在步骤1)中，采用YEP液体培养基，于28℃下将含有外源基因的农杆菌培养至OD600为0.5-0.8，即得所述处于对数生长期的含有外源基因的农杆菌。

优选的，在步骤1)中，所述第一培养基为含100-200μM的乙酰丁香酮(AS)的MS培养基。

优选的，在步骤1)中，将含有外源基因的农杆菌接种于含抗生素的YEP液体培养基中，28℃摇床过夜，再按体积百分比1％的接种量转接入50-800mL含抗生素的YEP液体培养基中，培养2-4小时至OD600为0.6，收集菌体；然后用50-800mL含100-200μM的乙酰丁香酮的MS培养基重新悬浮沉淀，将菌液转入50-800mL含100-200μM的乙酰丁香酮的MS培养基中，于28℃摇床上培养至OD600到0.6，即得转化菌液。

优选的，在步骤2)中，所述成熟的花生种子为刚好萌发、子叶分离的花生种子。

优选的，在步骤3)中，将所述转化受体浸泡在转化菌液中，使得转化菌液刚好浸没转化受体。

优选的，在步骤3)中，所述侵染的时间为30-50min。

优选的，在步骤5)中，花生幼苗在培养成花生植株的过程中，进行了炼苗、移栽及除草剂筛选的处理。

本发明还公开了上述利用花生子叶快速获得转基因花生的方法在制备转基因花生中的应用。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1.本发明采用花生子叶作为材料，通过农杆菌介导将外源基因导入花生细胞，直接通过细胞途径再生出转基因植株，整个过程只需要3个月，大大缩短了转基因花生研制周期。同时，转化所用的受体材料也容易得到，不需要对种皮进行剥离等特别处理，也不需要对种子严格进行子叶的分离，特别适合大规模的花生转基因批量生产。农杆菌转化技术已经广泛应用于植物转基因研究，有着成本低廉，效率高的特点。以抗草丁膦的Bar为目的基因对花生子叶进行转化，获得了含有Bar的抗除草剂转基因花生，证实了该方法的可行性。

2.与目前常用的转基因方法相比较，本发明的转基因方法不受材料限制，节约时间，不需要进行组织培养，不需要无菌操作等苛刻的试验条件，也避免了花生再生体系建立的困难。本方法以子叶为外源基因受体，通过细胞途径获得转基因植株，和以愈伤组织等其它受体的转基因方法相比，取材容易，也大大缩短了得到转基因花生植株的时间，更适合大规模的转基因花生研制。同时，方法培养时间短，避免了长期组织培养过程中，外源激素导致变异的影响。本方法采用花生子叶直接做为转基因受体，为获得转基因花生提供新方法。

3.本发明的转基因方法，转化效率高，得到的嵌合体少；而且具有可拓展性，可以适用于大规模转基因花生的研制，大大减少工作量，降低研究费用。

附图说明

图1为实施例1中获得的转基因花生PCR检测电泳结果；

图2为实施例2中获得的转基因花生PCR检测电泳结果；

图3为实施例3中获得的转基因花生PCR检测电泳结果；

图4为实施例4中获得的转基因花生PCR检测电泳结果。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

以下实施例中，LBA4404感受态细胞购买于宝生物工程(大连)有限公司，Bar基因来源于商业载体pCAMBIA3301。

实施例1

利用花生子叶快速获得转基因花生的方法，包括以下步骤：

①制备含有Bar基因的农杆菌LBA4404：将Pcambia3301质粒按照《分子克隆》的方法，导入到LBA4404细胞中。

②农杆菌的培养：挑取含有Bar基因的农杆菌LBA4404单菌落，接种于5ml含有50mg/L的利福平的YEB液体培养基中，28℃摇床过夜，接着将0.5ml菌液接种于50mL含有50mg/L的利福平的YEB液体培养基中培养至OD600为0.5左右。将菌液于4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。然后用5mL含100μM AS的MS培养基重新悬浮沉淀，再将菌液转入50mL的含100μM AS的MS培养基中，27℃摇床上培养至OD600为0.5，得到农杆菌转化菌液。

③转化受体的制备：取成熟的花生种子(航花2号广东省农业科学院作物研究所选育)，萌发5天后，用手术刀片将子叶纵切为两半，再切掉胚轴顶端的胚芽，得到转化受体。

④农杆菌侵染：

A、将步骤③制备的转化受体浸入步骤②制备的MS农杆菌转化菌液(含100μM AS)中，30min后将转化受体取出，中间轻缓晃动数次。

B、接着将转化受体表面的液体吸干，再将其置于含有湿润吸水纸上，于22±2℃暗培养3天，培养过程中喷施含7mg/L 6-BA的MS培养基，以保持吸水纸的湿润。

⑤抗除草剂转基因花生的再生与移栽：

A、选择培养：用自来水将经步骤④处理的转化受体冲洗干净，装入尼龙网，或者纱布包裹，或者继续放在湿润的吸水纸上进行选择培养，得到花生幼苗。培养过程中所喷施的培养液为：含2mg/L 6-BA和0.2vol.％草胺膦的MS培养基。

B、待苗高为2-3cm时，对其进行炼苗、移栽，得到转基因花生植株。

⑥抗除草剂转基因花生检测：

A、取种植在育苗盘中转基因花生植株叶片，采用微量法提取总DNA(王继华，李余良，胡建广等，一种转基因花生基因组DNA的快速提取方法，甘蔗糖业，2007，(6)：6-7)进行PCR扩增。

B、PCR扩增引物是依据质粒表达载体中Bar序列设计。上游序列：5'-ACCATCGTCAACCACTACAT-3'，下游序列：5'-AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。PCR反应体系：模板DNA 50-100ng，10×Buffer 1.5μL，10mmol/L dNTP 0.35μL，10mmol/L ZG3 0.35μL，10mmol/L ZG4 0.35μL，25mmol/L MgCl₂ 1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，补ddH₂O至15μL。反应条件：95℃预变性3min；95℃30sec，60℃40sec，72℃40sec，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

C、对得到的DNA序列进行质量体积比1％琼脂糖凝胶电泳检测，所得结果如图1所示。

从图1中可以看出，本实施例花生植株的PCR检测到了目的基因条带，说明该花生植株为抗除草剂转基因花生植株。

实施例2

利用花生子叶快速获得转基因花生的方法，包括以下步骤：

①制备含有Bar基因的农杆菌LBA4404：将Pcambia3301质粒按照《分子克隆》的方法，导入到LBA4404细胞中。

②农杆菌的培养：挑取含有Bar基因的农杆菌LBA4404单菌落，接种于5ml含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃摇床过夜，接着将0.5ml菌液接种于50mL含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中培养至OD600为0.5左右。将菌液于4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。然后用5mL含100μM AS的MS培养基重新悬浮沉淀，再将菌液转入50mL的含100μM AS的MS培养基中，27℃摇床上培养至OD600为0.5，得到农杆菌转化菌液。

③转化受体的制备：取成熟的花生种子(粤油7号，广东省农业科学院作物研究所选育)，萌发5天后，用手术刀片将子叶纵切为两半，再切掉胚轴顶端的胚芽，得到转化受体。

④农杆菌侵染：

A、将步骤③制备的转化受体浸入步骤②制备的MS农杆菌转化菌液(含100μM AS)中，30min后将转化受体取出，中间轻缓晃动数次。

B、接着将转化受体表面的液体吸干，再将其置于含有湿润吸水纸上，于22±2℃暗培养3天，培养过程中喷施含2mg/L 6-BA的MS培养基的液体营养液，以保持吸水纸的湿润。

⑤抗除草剂转基因花生的再生与移栽：

A、选择培养：用自来水将经步骤④处理的转化受体冲洗干净，装入尼龙网，或者纱布包裹，或者继续放在湿润的吸水纸上进行选择培养，得到花生幼苗。培养过程中所喷施的培养液为：含2mg/L 6-BA和0.2％vol.草胺膦的MS培养基。

B、待苗高为2-3cm时，对其进行炼苗、移栽，得到转基因花生植株。

⑥抗除草剂转基因花生检测：

A、取种植在育苗盘中转基因花生植株叶片，采用微量法提取总DNA(王继华，李余良，胡建广等，一种转基因花生基因组DNA的快速提取方法，甘蔗糖业，2007，(6)：6-7)进行PCR扩增。

B、PCR扩增引物是依据质粒表达载体中Bar序列设计。上游序列：5'-ACCATCGTCAACCACTACAT-3'，下游序列：5'-AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。PCR反应体系：模板DNA 50-100ng，10×Buffer 1.5μL，10mmol/L dNTP 0.35μL，10mmol/L ZG3 0.35μL，10mmol/L ZG4 0.35μL，25mmol/L MgCl₂ 1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，补ddH₂O至15μL。反应条件：95℃预变性3min；95℃30sec，60℃40sec，72℃40sec，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

C、对得到的DNA序列进行质量体积比1％琼脂糖凝胶电泳检测，所得结果如图2所示。

从图2中可以看出，本实施例的花生植株的PCR检测到了目的基因条带，说明该花生植株为抗除草剂转基因花生植株。

实施例3

利用花生子叶快速获得转基因花生的方法，包括以下步骤：

①制备含有Bar基因的农杆菌LBA4404：将Pcambia3301质粒按照《分子克隆》的方法，导入到LBA4404细胞中。

②农杆菌的培养：挑取含有Bar基因的农杆菌LBA4404单菌落，接种于5ml含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃摇床过夜，接着将0.5ml菌液接种于50mL含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中培养至OD600为0.5左右。将菌液于4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。然后用5mL含100μM AS的MS培养基重新悬浮沉淀，再将菌液转入50mL的含100μM AS的MS培养基中，27℃摇床上培养至OD600为0.5，得到农杆菌转化菌液。

③转化受体的制备：取成熟的花生种子(粤油7号，广东省农业科学院作物研究所选育)，用自来水浸泡30分钟后，用手术刀片将子叶纵切为两半，再切掉胚轴顶端的胚芽，得到转化受体。

④农杆菌侵染：

A、将步骤③制备的转化受体浸入步骤②制备的MS农杆菌转化菌液(含100μM AS)中，20min后将转化受体取出，中间轻缓晃动数次。

B、接着将转化受体表面的液体吸干，再将其置于含有湿润吸水纸上，于22±2℃暗培养4天，培养过程中喷施含5mg/L 6-BA的MS培养基，以保持吸水纸的湿润。

⑤抗除草剂转基因花生的再生与移栽：

A、选择培养：用自来水将经步骤④处理的转化受体冲洗干净，装入尼龙网，或者纱布包裹，或者继续放在湿润的吸水纸上进行选择培养，得到花生幼苗。培养过程中所喷施的培养液为：含2mg/L 6-BA和0.2％vol.草胺膦的MS培养基。

B、待苗高为2-3cm时，对植株进行炼苗、移栽，得到转基因花生植株。

⑥抗除草剂转基因花生检测：

A、取种植在育苗盘中转基因花生植株叶片，采用微量法提取总DNA(王继华，李余良，胡建广等，一种转基因花生基因组DNA的快速提取方法，甘蔗糖业，2007，(6)：6-7)进行PCR扩增。

B、PCR扩增引物是依据质粒表达载体中Bar序列设计。上游序列：5'-ACCATCGTCAACCACTACAT-3'，下游序列：5'-AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。PCR反应体系：模板DNA 50-100ng，10×Buffer 1.5μL，10mmol/L dNTP 0.35μL，10mmol/L ZG3 0.35μL，10mmol/L ZG4 0.35μL，25mmol/L MgCl₂ 1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，补ddH₂O至15μL。反应条件：95℃预变性3min；95℃30sec，60℃40sec，72℃40sec，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

C、对得到的DNA序列进行质量体积比1％琼脂糖凝胶电泳检测，所得结果如图3所示。

从图3中可以看出，本实施例花生植株的PCR检测到了目的基因条带，说明该花生植株为抗除草剂转基因花生植株。

实施例4

利用花生子叶快速获得转基因花生的方法，包括以下步骤：

①制备含有Bar基因的农杆菌LBA4404：将Pcambia3301质粒按照《分子克隆》的方法，导入到LBA4404细胞中。

②农杆菌的培养：挑取含有Bar基因的农杆菌LBA4404单菌落，接种于5ml含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃摇床过夜，接着将0.5ml菌液接种于50mL含有50mg/L利福平的YEB液体培养基中培养至OD600为0.5左右。将菌液于4℃、5000rpm离心5min，收集菌体。然后用5mL含100μM AS的MS培养基重新悬浮沉淀，再将菌液转入50mL的含100μM AS的MS培养基中，27℃摇床上培养至OD600为0.5，得到农杆菌转化菌液。

③转化受体的制备：取成熟的花生种子(航花2号广东省农业科学院作物研究所选育)，萌发1天后，用手术刀片将子叶纵切为两半，再切掉胚轴顶端的胚芽，得到转化受体。

④农杆菌侵染：

A、将步骤③制备的转化受体浸入步骤②制备的MS农杆菌转化菌液(含100μM AS)中，50min后将转化受体取出，中间轻缓晃动数次。

B、接着将转化受体表面的液体吸干，再将其置于含有湿润吸水纸上，于22±2℃暗培养4天，培养过程中喷施含2mg/L 6-BA的MS培养基，以保持吸水纸的湿润。

⑤抗除草剂转基因花生的再生与移栽：

A、选择培养：用自来水将经步骤④处理的转化受体冲洗干净，装入尼龙网，或者纱布包裹，或者继续放在湿润的吸水纸上进行选择培养，得到花生幼苗。培养过程中所喷施的培养液为：含3mg/L 6-BA和0.2％vol.草胺膦的MS培养基。

B、待苗高为2-3cm时，对植株进行炼苗、移栽，得到转基因花生植株。

⑥抗除草剂转基因花生检测：

A、取种植在育苗盘中转基因花生植株叶片，采用微量法提取总DNA(王继华，李余良，胡建广等，一种转基因花生基因组DNA的快速提取方法，甘蔗糖业，2007，(6)：6-7)进行PCR扩增。

B、PCR扩增引物是依据质粒表达载体中Bar序列设计。上游序列：5'-ACCATCGTCAACCACTACAT-3'，下游序列：5'-AGTCCAGCTGCCAGAAACCC-3'。PCR反应体系：模板DNA 50-100ng，10×Buffer 1.5μL，10mmol/L dNTP 0.35μL，10mmol/L ZG3 0.35μL，10mmol/L ZG4 0.35μL，25mmol/L MgCl₂ 1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，补ddH₂O至15μL。反应条件：95℃预变性3min；95℃30sec，60℃40sec，72℃40sec，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

C、对得到的DNA序列进行质量体积比1％琼脂糖凝胶电泳检测，所得结果如图4所示。

从图4中可以看出，本实施例花生植株的PCR检测到了目的基因条带，说明该花生植株为抗除草剂转基因花生植株。

图1-图4的结果表明，采用本发明的方法，可快速获得大量的转基因花生，说明该转基因方法切实可行，为批量获得转基因花生提供了新思路。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。