本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种通过瞬时表达对植物基因进行定点插入的方法及获得的瞬时表达细胞、组织和突变植株。
背景技术：
：：基因组定点修饰工具主要包括三大类型序列特异性核酸酶：锌指核酸酶(Zincfingernuclease,ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)和成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPRassociated,CRISPR/Cas9system)。它们的共同特征是能够作为核酸内切酶切割特定的基因组DNA序列，产生基因组DNA双链断裂(Double-strandbreak,DSB)。如果在产生DNA双链断裂的同时人为提供一段DNA序列(供体DNA)，该供体DNA序列可以定向的插入基因组DNA双链断裂处，从而产生供体DNA的定点插入。瞬时表达体系是指利用农杆菌、基因枪、PEG等诱导原生质体转化等方法将外源基因(序列特异性核酸酶及供体DNA序列)转入细胞中，通过外源基因的瞬时表达实现对植物基因组改造，由于瞬时表达后的细胞或组织在无选择压力的情况下进行再生，可以提高植物的再生效率；同时，未整合到植物基因组上的外源基因会被植物细胞降解，这样获得的突变体植物具有较高的生物安全性。所以，通过瞬时表达体系更容易，更适合实现对植物基因组的改造，有利于基因编辑技术在植物上的有效利用。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是，提供一种通过瞬时表达对植物基因进行定点插入的方法及获得的瞬时表达细胞、组织和定点插入突变植株。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种通过瞬时表达对植物基因进行定点插入的方法，包括如下步骤：以目的植物的细胞或组织为瞬时表达对象，在目的植物的细胞或组织中瞬时表达序列特异性核酸酶及一段供体DNA序列，在特异性核酸酶的作用下，目的基因被剪切并产生双链断裂，供体DNA序列插入到双链断裂处，完成对基因的定点插入。在所述目的植物的细胞或组织中瞬时表达序列特异性核酸酶及一段供体DNA序列包括如下步骤：向目的植物的细胞或组织中直接导入靶标片段的核酸酶或导入用于表达特异于靶标片段的核酸酶的遗传物质，同时导入供体DNA序列。所述遗传物质为DNA质粒、DNA线性片段或体外转录的RNA。所述序列特异性核酸酶为能实现基因组编辑的核酸酶，锌指核酸酶ZFN、类转录激活因子效应物核酸酶TALEN或CRISPR/Cas9核酸酶。所述供体DNA序列为单链DNA或双链DNA。所述细胞为任何能作为瞬时表达受体并能经过组织培养再生为完整植株的细胞；所述组织为任何能作为瞬时表达受体并能经过组织培养再生为完整植株的组织。所述细胞为原生质体细胞或悬浮细胞；所述组织为愈伤组织、幼胚、成熟胚、叶片、茎尖、幼穗或下胚轴。向所述目的植物的细胞或组织中导入序列特异性核酸酶及一段供体DNA序列方法为基因枪法、农杆菌侵染法、PEG诱导原生质体法、电极法、碳化硅纤维介导法或真空渗入法。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。上述方法获得的瞬时表达细胞、瞬时表达组织和培养后得到的定点插入突变植株。本发明的有益效果是：可以实现定点转基因，消除随机整合带来的负效应。可以实现基因叠加，将多个优良性状结合在一起。通过分子标记的定点插入，可以标记特定基因。通过基因调控元件的定点插入，可以调控特定基因的表达。附图说明图1为原生质体中瞬时表达CRISPR/Cas9系统对小麦的内源基因TaGW2的定点突变结果图(a为电泳图，b为回收a中未切开条带测序结果)。图2为基因枪法瞬时表达CRISPR/Cas9系统及供体DNA序列(ssDNA-1)对小麦的内源基因TaGW2的定点插入结果图(a为电泳图，b为回收a中条带测序结果。图3为基因枪法瞬时表达TALEN系统及供体DNA序列(ssDNA-2)对小麦的内源基因TaMLO的定点插入结果图(a为电泳图，b为回收a中条带测序结果)。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。表达载体pTaU6-gRNA：在文献“Shan,Q.etal.TargetedgenomemodificationofcropplantsusingaCRISPR-Cassystem.NatureBiotechnology31:686-688,(2013)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。表达载体p163-Ubi-Cas9及小麦TaMLO基因靶向TALENs载体T-MLO：在文献“Wang,Y.,Cheng,X.,Shan,Q.,Zhang,Y.,Liu,J.,Gao,C.,andQiu,J.L.(2014).Simultaneouseditingofthreehomoeoallelesinhexaploidbreadwheatconfersheritableresistancetopowderymildew.NatureBiotechnology.32,947–951”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。小麦品种“科农199”在文献“李俊明；张相岐；张爱民；王志国；安调过；纪军；王静.高产广适小麦新品种—科农199.麦类作物学报.368-368(2007)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。小麦品种“Bobwhite”在文献“Souzaetal.Parentageanalysisofinternationalspringwheatyieldnurseries.CropSci.38:337–341，(1998)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。实施例1、利用基因枪法瞬时表达CRISPR/Cas9核酸酶及供体DNA序列获得小麦内源基因TaGW2的定点插入突变体一、靶标片段target-C14的设计Target-C14：5’-CCTCTAGAAATACCCCATCCTG-3’；(GenbankNo.HQ404374所示的TaGW2基因中，第802-823位，SEQIDNO.1)二、含有C14核苷酸片段pTaU6-gRNA质粒的制备C14是能与靶标target-C14互补结合的RNA的编码DNA。合成下述带有粘性末端(下划线部分)的单链引物：C14F：5’-CTTGCAGGATGGGGTATTTCTAG-3’SEQIDNO.2C14R：5’-AAACCTAGAAATACCCCATCCTG-3’SEQIDNO.3经过引物退火程序形成有粘性末端的双链DNA，插入到pTaU6-gRNA质粒的两个BbsI酶切位点之间，即得含有C14的pTaU6-gRNA质粒，质粒经测序验证阳性质粒，即在pTaU6-gRNA质粒的酶切位点BbsI处正向插入5’-CTTGCAGGATGGGGTATTTCTAG-3’所示DNA片段后得到的重组质粒为阳性，命名为pTaU6-gRNA-C14。三、将CRISPR/Cas9系统导入至小麦原生质体将p163-Ubi-Cas9载体和步骤二获得的pTaU6-gRNA-C14质粒导入至小麦原生质体，具体过程如下：1.小麦苗的种植小麦种子种于培养室，温度25±2℃，光照度1000Lx，光照14～16h/d的条件下培养，培养时间约1-2周。2.原生质体分离1)取小麦幼嫩的叶片，用刀片将其中间部分切成0.5-1mm的丝，放入0.6M的甘露醇溶液(溶剂为水)中避光处理10分钟，再用滤网过滤，将其放入50ml酶解液中消化5小时(先抽真空酶解0.5h，再10rmp缓慢摇晃4.5h)。注：酶解温度要保持在20-25℃，且要避光，酶解完轻轻摇晃酶解液，使原生质体释放出来。2)加10mlW5稀释酶解产物，用75μm尼龙滤膜过滤酶解液于50ml圆底离心管中。注：尼龙滤膜要浸泡在75％(体积分数)酒精里，用时要用水冲洗，再用W5浸泡2min再过滤。3)23℃，100g，离心3min，弃上清。4)用10mlW5轻轻悬起，冰上放置30min；原生质体逐渐沉降，弃上清。5)加适量MMG溶液悬浮，至于冰上，待转化。注：此时需要确定原生质体的浓度，镜检(×100)，原生质体数为2×105/ml至1×106/ml。3.小麦原生质体转化1)加10μgp163-Ubi-Cas9载体和10μgpTaU6-gRNA-C14质粒于2ml离心管，用枪头吸取200μl步骤2获得的原生质体轻弹混匀，静止3-5min，再加250μlPEG4000，轻弹混匀，避光诱导转化30min；2)加900μlW5(室温)颠倒混匀，100g，离心3min，弃上清；3)加1mlW5，颠倒混匀，轻轻转至6孔板中，已预先加入1mlW5，23℃培养过夜。四、PCR/RE实验分析CRISPR/Cas9系统对小麦内源基因TaGW2的突变结果小麦原生质体转化后48小时提取基因组DNA，以该DNA为模板，进行PCR/RE(PolymeraseChainReaction/Restrictiondigestion)实验分析。同时设置野生型小麦的原生质体作为对照。PCR/RE分析方法参考了文献Shan,Q.etal.RapidandefficientgenemodificationinriceandBrachypodiumusingTALENs.MolecularPlant(2013)，由于小麦内源基因TaGW2(GenbankNo.HQ404374)的靶标片段(GenbankNo.HQ404374的第802-823位)上存在限制性内切酶XbaI的识别序列(5’-TCTAGA-3’)，因而实验中采用限制性内切酶XbaI进行PCR/RE检测实验。其中，PCR扩增所用引物为：TaGW2-F：5’-TCCTGCTTGTGGGAGCTTTATG-3’SEQIDNO.4TaGW2-R：5’-ATGCCAACCCTTGCGTGTGCGT-3’SEQIDNO.5PCR/RE实验分析结果见图1(a为电泳图。其中，第1泳道为Marker；Marker从下往上依次为100、250、500、750、1000、2000、3000bp；泳道2和3为导入了sgRNA：Cas9系统的原生质体DNA的PCR产物经内切酶XbaI酶切结果；泳道4为野生的原生质体DNA的PCR产物经内切酶XbaI酶切结果；泳道5为野生型的原生质体PCR产物。b为回收a中未切开条带测序结果，表明在TaGW2基因的靶位点发生了定点突变。WT表示野生型基因序列，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量，小写字母为插入的核苷酸)。结果表明在TaGW2基因靶位点发生了突变，回收测序图中的条带，测序结果表明在TaGW2基因的靶位点都发生了碱基插入/删除(insertion/deletion,indel)类型的突变。五、利用基因枪法瞬时表达CRISPR/Cas9系统及供体DNA序列(ssDNA-1)对小麦内源基因TaGW2进行定点插入。ssDNA-1序列(114bp)：其中下划线标识的为同源序列，即基因组上双链断链两侧的序列；其他为loxP序列；边框内的序列为HindIII酶切位点。1)取“科农199”小麦幼胚用高渗培养基进行高渗处理4小时；2)使用基因枪对经步骤1)所述高渗培养的小麦幼胚进行轰击，将pTaU6-gRNA-C14质粒，p163-Ubi-Cas9载体以及单链供体ssDNA-1导入所述小麦幼胚细胞中；每次所述轰击的轰击距离为6cm，轰击压力为1100psi，轰击直径为2cm，所述轰击使用金粉对待导入DNA进行分散；每次所述轰击中所述金粉的使用量为200μg，所述待导入DNA为0.1μg(pTaU6-gRNA-C14质粒，p163-Ubi-Cas9载体以及单链供体ssDNA-1各0.033μg)；所述金粉的粒径为0.6μm。3)将经步骤2)所述轰击的小麦幼胚进行高渗培养16小时；4)将经步骤3)所述高渗培养的小麦幼胚依次进行14天愈伤组织诱导培养、28天分化培养和14-28天生根培养，获得小麦植株。5)将经步骤4)产生的500×4株“科农199”小麦幼苗提取DNA，经PCR扩增检测得到2株具有明显基因定点插入的突变体。6)对2株插入突变体中的TaGW2基因进行A、B、D特异性扩增，发现2株植物的定点插入均发生在D基因组上，其中，特异引物分别为：6AS-F：CTGCCATTACTTTGTATTTTGGTAATASEQIDNO.76BS-F：GTTCAGATGGCAATCTAAAAGTTSEQIDNO.86DS-F:GCATGTACTTTGATTGTTTGCGTGASEQIDNO.96S-2R：TCCTTCCTCTCTTACCACTTCCCSEQIDNO.10突变体的检测结果如图2(a为电泳图。其中，第1泳道为Marker；从下往上依次为100、250、500、750、1000bp；第2，3泳道为检测突变体定点插入结果，第4泳道为野生型对照。b为回收a中条带测序结果，表明在TaGW2基因的靶位点发生了定点插入。其中，WT表示野生型基因序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量，下划线标记(碱基为部分供体DNA序列)。结果表明在TaGW2基因靶位点发生了定点插入，回收测序图中的条带，测序结果证实了突变的产生(测序结果见图2中b)。实施例2、利用基因枪法瞬时表达TELEN核酸酶及供体DNA序列获得小麦内源基因TaMLO的定点插入突变体一、靶序列的设计选择TaMLO基因为目的基因，利用已发表的TaMLO基因靶向TALENs载体T-MLO表达特异于靶标片段的核酸酶。T-MLO载体可表达成对TALEN蛋白，所述TALEN蛋白由能够识别靶标片段并与其结合的DNA结合域和FokI结构域组成。靶标片段为：TaMLO-A基因:TaMLO-B基因:TaMLO-D基因：二、利用基因枪法瞬时表达T-MLO及供体DNA序列(ssDNA-2)对小麦内源基因MLO基因进行定点插入；ssDNA-2序列(75bp)：CGCTGCTGCTCGCCGTCACGCAGAACAGAAACTGATCTCTGAAGAAGACCTGCCATCTCCGGGATATGCATCTCCSEQIDNO.11其中下划线标识部分为同源序列，即基因组上双链断链两侧的序列；未标记部分为Myc-Tag序列。(1)以小麦品种“Bobwhite”幼胚为材料，进行基因枪介导的瞬时转化，转化及组织培养过程见实施例1中步骤五。(2)将经步骤(1)产生的200×4株小麦幼苗提取DNA。利用通用引物进行PCR扩增MLO基因，检测得到1株具有明显基因定点插入的突变体。所用引物序列为：TaMLO-F:GTCTTCGCCGTCATGATCATCGTCTCCSEQIDNO.12TaMLO-R:TGGTATTCCAAGGAGGCGGTCTCTGTCTSEQIDNO.13(3)将该插入突变体TaMLO基因进行A、B、D特异性扩增，发现定点插入发生在A基因组上。用于扩增TaMLO-A基因的引物对如下：上游引物：5’-TGGCGCTGGTCTTCGCCGTCATGATCATCGTC-3’SEQIDNO.14下游引物：5’-TACGATGAGCGCCACCTTGCCCGGGAA-3’SEQIDNO.15用于扩增TaMLO-B基因的引物对如下：上游引物：5’-ATAAGCTCGGCCATGTAAGTTCCTTCCCGG-3’SEQIDNO.16下游引物：5’-CCGGCCGGAATTTGTTTGTGTTTTTGTT-3’SEQIDNO.17用于扩增TaMLO-D基因的引物对如下：上游引物：5’-TGGCTTCCTCTGCTCCCTTGGTGCACCT-3’SEQIDNO.18下游引物：5’-TGGAGCTGGTGCAAGCTGCCCGTGGACATT-3’SEQIDNO.19突变体的检测结果如图3所示(a为电泳图。其中，第1泳道为Marker；Marker从下往上依次为100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp；第2泳道为检测突变体定点插入结果，第3泳道为野生型对照。b为回收a中条带测序结果，表明在TaMLO基因的靶位点发生了定点插入。其中，WT表示野生型基因序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸的数量，标记碱基为部分供体DNA序列)。结果表明在TaMLO基因靶位点发生了定点插入，回收测序图中的条带，测序结果证实了突变的产生(测序结果见图3中b)。采用所述方法对植物的目的基因进行定点插入，从而获得的瞬时表达细胞或所述瞬时表达组织属于本发明的保护范围。由所述瞬时表达细胞或所述瞬时表达组织培养后得到的定点插入突变植株也属于本发明的保护范围。以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。SEQUENCELISTING<110>吉诺沃生物科技有限公司<120>通过瞬时表达对植物基因进行定点插入的方法及获得的瞬时表达细胞、组织和突变植株<130><160>17<170>PatentInversion3.5<210>1<211>22<212>DNA<213>小麦（Triticumaestivum）<400>1cctctagaaataccccatcctg22<210>2<211>23<212>DNA<213>小麦（Triticumaestivum）<400>2cttgcaggatggggtatttctag23<210>3<211>23<212>DNA<213>小麦（Triticumaestivum）<400>3aaacctagaaataccccatcctg23<210>4<211>22<212>DNA<213>小麦（Triticumaestivum）<400>4tcctgcttgtgggagctttatg22<210>5<211>22<212>DNA<213>小麦（Triticumaestivum）<400>5atgccaacccttgcgtgtgcgt22<210>6<211>114<212>DNA<213>人工序列<400>6ccaccaggatggggtatttcataacttcgtatagcatacattatacgaagttataagctt60ataacttcgtatagcatacattatacgaagttattagaggaggagctgcaacga114<210>7<211>27<212>DNA<213>小麦（Triticumaestivum）<400>7ctgccattactttgtattttggtaata27<210>8<211>23<212>DNA<213>小麦（Triticumaestivum）<400>8gttcagatggcaatctaaaagtt23<210>9<211>25<212>DNA<213>小麦（Triticumaestivum）<400>9gcatgtactttgattgtttgcgtga25<210>10<211>23<212>DNA<213>小麦（Triticumaestivum）<400>10tccttcctctcttaccacttccc23<210>11<211>75<212>DNA<213>人工序列<400>11cgctgctgctcgccgtcacgcagaacagaaactgatctctgaagaagacctgccatctcc60gggatatgcatctcc75<210>12<211>27<212>DNA<213>小麦（Triticumaestivum）<400>12gtcttcgccgtcatgatcatcgtctcc27<210>13<211>28<212>DNA<213>小麦（Triticumaestivum）<400>13tggtattccaaggaggcggtctctgtct28<210>14<211>32<212>DNA<213>小麦（Triticumaestivum）<400>14tggcgctggtcttcgccgtcatgatcatcgtc32<210>15<211>27<212>DNA<213>小麦（Triticumaestivum）<400>15tacgatgagcgccaccttgcccgggaa27<210>16<211>30<212>DNA<213>小麦（Triticumaestivum）<400>16ataagctcggccatgtaagttccttcccgg30<210>17<211>28<212>DNA<213>小麦（Triticumaestivum）<400>17ccggccggaatttgtttgtgtttttgtt28当前第1页1 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