一种外源基因在南瓜果实中的瞬时表达方法与流程

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种外源基因在南瓜果实中的瞬时表达方法。

背景技术：

南瓜（Cucurbita moschata）是热带亚热带的一年生草本植物，果实含有丰富的营养功能代谢物质，是研究果实营养功能物质合成的理想生物材料。由于瓜类的整个遗传改良方法不成熟，尤其是中国南瓜（C. moschata）遗传改良暂无报道，而传统的育种技术已不能满足对果实品质研究的需要。瞬时表达（transient express）是导入外源基因后在短时间内检测到其表达产物和表达功能的外源基因表达方式。农杆菌介导的瞬时表达方法已经在很多转基因植物中应用，与传统转基因过程相比，其周期短、安全、转化效率高、操作简单。但目前主要是利用农杆菌介导在叶、根、茎等组织，较少在南瓜这样的大型果实进行转化。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种外源基因在南瓜果实中的瞬时表达方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种外源基因在南瓜果实中的瞬时表达方法，包括如下步骤：

（1）将外源基因插入植物表达载体中；

（2）将步骤（1）得到的表达载体转化到农杆菌感受态细胞中，得到含有植物表达载体的农杆菌悬液；

（3）选取发育正常的雌花，待开花2-5天后，挑选与其花相连的南瓜幼果，缓慢注射步骤（2）制备得到的农杆菌悬浮液，使菌液渗入果肉；

（4）瞬时转化后2-5天，即可观察外源基因在南瓜果实中的表达情况。

作为优选的，所述植物表达载体包括：pBI121或pMOG800。

所述外源基因为衣藻CRBKT基因。

作为优选的，步骤（2）的具体操作为：将含有外源基因的植物表达载体添加到农杆菌感受态细胞悬液中，冰上放置25-35min，然后将细胞悬液在40-45℃水浴中热激50-70s，迅速移出冰上放置冷却。

作为优选的，步骤（3）所述农杆菌悬浮液的浓度为OD₆₀₀=0.3-0.5。

所述农杆菌悬浮液的组成包括：MES、MgCl₂及AS。

作为优选的，所述农杆菌悬浮液的组成包括：10 mM MES、10mM MgCl₂及200μM AS。

作为优选的，所述农杆菌悬浮液的注射量为80-100μL。

本发明的有益效果是：

本发明的目的在于提供一种将外源基因转入南瓜果实进行瞬时表达的方法，以农杆菌为介导，通过构建植物过表达载体，使外源基因在果实中表达，从而分析基因在果实中的功能和作用。本发明采用的果实瞬时转化，具有遗传转化简单、难度小、效率高等优点，为有效分析果实相关基因功能、启动子活性分析、亚细胞定位、制备蛋白等奠定基础。

附图说明

图1为植物过表达载体pBI121-CRBKT的结构示意图；

图2为实施例中外源基因CRBKT(SEQ: NO.1)在南瓜幼果中的表达情况；

图3为实施例中外源基因CRBKT(SEQ: NO.1)在南瓜成熟果实中的表达情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

1、表达载体的构建

衣 藻 Chlamydomonas reinhardtii cc-124 由 Chamydomonas Center (Duke University, USA) 提供，衣藻用 TAP培养液 /基培养。利用PCR技术从衣藻的cDNA中获得CRBKT基因序列（SEQ ID NO.1），获得步骤如下：1.应用引物SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3克隆获得切去C-末端115个氨基酸的改造后CRBKT，采用测序手段验证为CRBKT的全长序列，PCR产物经过Hind 和Xba 酶切后连接到pBluescript KS相应位置产生pCRBKT载体。采用PCR技术从南瓜的cDNA中应用引物SEQ NO.4和SEQ NO.5克隆获得RBCS1 (ribulose-1,5-biosphosphate carboxylase small subunit，来源于南瓜转录组)的信号肽CMTP，采用测序手段验证为CMTP的序列。PCR产物经过纯化和Sal及Hind的酶切连接到pCRBKT的相应位置。插入序列经过测序验证，产生的CMTP和BKT的连接体经过Sma和Sac的酶切连接到pBI121的相应位置，产生pBI121-CRBKT用于南瓜转化。

Zhong et al.(Journal of Experimental Botany, 2011, 62:3659-3669)报道表明CRBKT基因在拟南芥叶片、番茄果实等组织中的表达后改变叶片和果实类胡萝卜素组成，产生红色的酮化类胡萝卜素包括虾青素、角黄素等其他酮化类胡萝卜素，从而使叶片或果实呈现棕红色或血红色.

2、制备含有pBI121-CRBKT的农杆菌

分别将2μL制得的pBI121-CRBKT质粒添加到 200μL的 LBA4404感受态细胞悬液中，轻轻混匀，在冰上放置 30 分钟。然后将细菌悬浮液在 42℃水浴中热激 60 秒，迅速移至冰上放置 5 分钟冷却。分别在细菌悬浮液中加入 800μL的 LB 液体培养基，于 28℃复苏 3 小时。取适量细菌悬浮液涂布于含有50 mg/L链霉素和50 mg/L卡那霉素的LB板上，将板置于28℃温浴2天。从平板上挑取单菌落，经PCR鉴定和扩增提取质粒酶切鉴定。将含有相应的质粒的农杆菌进行植物转化。首先将100μL农杆菌培养液接入3ml的LB液体培养液含有50 mg/L链霉素和50 mg/L卡那霉素培养，培养两天当OD₆₀₀=0.8。

3、南瓜果实瞬时表达

实验植物：南瓜(香蜜小南瓜品种)种植于广东省农业科学院白云基地，挑选一定数量大小均匀的开花后2，5，10，15，25天果实进行后续实验。

将培养的农杆菌离线收集到悬浮液（10 mMMES+10mM MgCl₂ + 200μM AS）中，调整其浓度到OD为0.1-0.2，0.3-0.5，0.6-0.8菌液配制后于室温预培养2-4小时。将盛有100μL菌液的注射器针头插入果皮，缓慢推动注射器使菌液渗入果肉，并用记号笔在针头注入位置做标记。每次实验中，都要设计严格的阴性对照，即注入含有pBI121对照的农杆菌菌株渗透液，目的基因和阴性对照注射位置相同。

注射后1天，2-5天，8-12天切开注射部位观察，发现仅2-5天果肉颜色较对照红，果肉表型如附图2，与对照相比，注射pBI121- CRBKT的果肉和瓤出现红色色素积累。收集红色部位组织样品，色素成分分析采用高效液相色谱（HPLC），仪器设备采用 Waters HPLC 系统 (Waters, Milford, MA, USA) 装备一根 Waters Spherisorb® 5 μm ODS2 4. 6 250 mm分析柱。方法采用Baroli（Plant Cell 15: 992-1008, 2003）所述方法，改进后如下：从 100% 溶液 A[acetonitrile/methanol/0. 1 M Tris-HCl (pH 8.0),84:2:14, v/v/v] 遵循线形 梯度到 100%溶液B(methanol/ethyl acetate, 68:32, v/v)，流速为 1.2mL/min，维持15分钟，接着10分钟溶液B。色素用标准色素样品通过光吸收峰和出现时间确定，色素定量也采用标准色素样品定量，所有标准色素样品购于Sigma和Wako。HPLC分析表明pBI121- CRBKT的表达导致酮化类胡萝卜素角黄素和少量的虾青素产生，这两个色素均为红色从而导致果肉颜色变为红色。而开花后10天以上果实中菌液无法渗入果肉且果实次生代谢物的增加农杆菌无法存活，果肉无酮化类胡萝卜素积累；OD在0.1-0.2之间，表型不明显，OD在0.6-0.8未观察到侵染，反而出现白色的斑，可能原因是果肉在过高浓度的农杆菌下引起细胞和组织的破坏；注射后1天的表型不明显，2-5天最佳，8-12天后果实的代谢积累和果实的变大导致表型不明显。总体上，由于南瓜果实的含水量低于叶片、水果果肉组织，且南瓜的果肉中含有大量的次生代谢物如果胶、淀粉等影响农杆菌活性，果实的膨大发育速度较快，表达时间难以掌握，因而相比其他的叶片和水果更难于表达外源基因。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 一种外源基因在南瓜果实中的瞬时表达方法

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 987

<212> DNA

<213> Chlamydomonas reinhardtii

<400> 1

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cgctcgcgta ggatggcgga ggacatactg aagctgtggc agcgccaata tcacctgccg 180

cgcgaggatt ctgacaagcg cacgctgcgc gagcgcgttc acctgtaccg cccgccgcgt 240

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tcctgggcaa ccattgctgc tgtattcttt agcctggaat tcctttacac cgggctcttc 420

atcaccacgc acgacgcgat gcatggcacc atcgcgctgc gcaaccggcg cctgaacgac 480

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aagcactggg agcaccacaa ccacaccggg gagccgcgtg tggatccgga cttccaccgc 600

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<213> 人工序列

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